基于NF-KB通路抑制的姜黃素抗胃癌機(jī)理的研究.pdf

1、目的：
　　1.觀察姜黃素（curcumin）刺激胃癌細(xì)胞SGC7901后，NF-κB通路相關(guān)因子IκBα在轉(zhuǎn)錄水平（mRNA）、蛋白水平的表達(dá)及IκBα磷酸化變化，NF-κB與其靶序列結(jié)合能力及其核定位的影響，初步探討姜黃素對(duì)胃癌細(xì)胞SGC7901中NF-κB通路的影響。
　　2.觀察姜黃素（curcumin）對(duì)胃癌細(xì)胞SGC7901誘導(dǎo)后，胃癌細(xì)胞SGC7901中IL-1、IL-2、IL-4和Lin-28等因子在轉(zhuǎn)錄水平

2、及蛋白水平的表達(dá)變化，從細(xì)胞微炎癥角度探討姜黃素（curcumin）抑制由LPS刺激胃癌細(xì)胞SGC7901引起的炎癥。
　　3.觀察姜黃素（curcumin）對(duì)胃癌細(xì)胞SGC7901及采用RNA干擾（RNAi）方法沉默let-7a的胃癌細(xì)胞SGC7901（胃癌細(xì)胞SGC7901-let7a-）誘導(dǎo)后，胃癌細(xì)胞SGC7901中小分子RNA let-7a表達(dá)量的變化，探討姜黃素誘導(dǎo)與let-7a表達(dá)量變化之間的關(guān)系。
　　4.觀

3、察姜黃素（curcumin）刺激胃癌細(xì)胞 SGC7901及胃癌細(xì)胞SGC7901-let7a-后，胃癌細(xì)胞SGC7901及胃癌細(xì)胞SGC7901-let7a-凋亡及集落形成能力的變化，姜黃素是否通過增加let7a的方式來發(fā)揮其抗癌作用。
　　方法：
　　1.胃癌細(xì)胞SGC7901先用不同濃度的姜黃素[0μmol/L(normal control),10μmol/L,30μmol/L,50μmol/L]孵育10小時(shí)，然后用0.

4、1μg/ml LPS處理1h，通過半定量逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)IκBα的mRNA表達(dá)水平，Western Blotting檢測(cè)IκBα的蛋白表達(dá)水平及其磷酸化，電泳遷移率實(shí)驗(yàn)(EMSA）檢測(cè)核因子-κB(NF-κB)與其靶序列結(jié)合能力。
　　2.胃癌細(xì)胞SGC7901先用不同濃度的姜黃素[0μmol/L(normal control),10μmol/L,30μmol/L,50μmol/L]孵育10小時(shí)，然后用0.1μg/ml LPS處理

5、1h，通過半定量逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)IL-1、IL-2、IL-4 and Lin-28等的mRNA表達(dá)水平，Western Blotting檢測(cè)IL-1、IL-2、IL-4and Lin-28等的蛋白表達(dá)水平。
　　3.由以上結(jié)果得出最適姜黃素濃度處理胃癌細(xì)胞SGC7901與胃癌細(xì)胞SGC7901-let7a-10小時(shí)，然后用0.1μg/mlLPS處理1h，通過Northern Blotting分析let-7a的表達(dá)量變化。
　

6、　4.用不同濃度姜黃素[0μmol/L(normal control),10μmol/L,50μmol/L]處理胃癌細(xì)胞SGC7901與胃癌細(xì)胞SGC7901-let7a-48小時(shí)，流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡及細(xì)胞集落形成刺激實(shí)驗(yàn)檢測(cè)let-7a沉默對(duì)胃癌細(xì)胞SGC7901的影響。
　　結(jié)果：
　　1.姜黃素可以顯著地增加IκBα轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果表明LPS誘導(dǎo)1小時(shí)就可顯著降低IκBα的水平，而30μM的姜黃素可以通過增加IκBα

7、表達(dá)水平、抑制IκBα磷酸化來阻滯LPS介導(dǎo)的IκBα水平下降。蛋白雜交分析和免疫組化研究同樣表明，姜黃素可以阻止LPS介導(dǎo)的p50/p65轉(zhuǎn)核作用。0.1μg/mL LPS可以顯著增加細(xì)胞核蛋白對(duì)于NF-κB DNA的結(jié)合。添加姜黃素處理后，LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞核蛋白對(duì)于NF-κB DNA的結(jié)合效率明顯降低。
　　2.實(shí)驗(yàn)采用半定量逆轉(zhuǎn)錄PCR和蛋白雜交等方法檢測(cè)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的水平。本定量PCR的檢測(cè)結(jié)果表明，LPS能顯著增加IL-

8、1、IL-2、L-4、STAT3和Lin-28的轉(zhuǎn)錄水平，而姜黃素可以以濃度依賴的方式，有效的降低 LPS誘導(dǎo)的IL-1、L-4、TNFα、STAT3和Lin-28的轉(zhuǎn)錄水平，但對(duì)IL-2轉(zhuǎn)錄水平的影響不顯著。蛋白雜交的結(jié)果同樣顯示，姜黃素能降低胃癌細(xì)胞SGC7901中這些癌癥潛在激活因子（IL-1、IL-4、TNFα、STAT3和Lin-28）的蛋白水平。
　　3.Northern雜交結(jié)果顯示，反義RNA可以抑制let7a的表達(dá)

9、。通過流式細(xì)胞分析發(fā)現(xiàn)，姜黃素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，隨著細(xì)胞內(nèi)let7a的表達(dá)抑制而降低。這表明let7a在姜黃素抗癌活性中起到重要的作用。
　　結(jié)論：
　　姜黃素可以抑制NF-κB通路的激活。姜黃素抑制NF-κB通路，主要是通過特異性的激活表達(dá)，抑制IKK途徑降低IκBα的降解，達(dá)到抑制NF-κB轉(zhuǎn)移入細(xì)胞核的目的。抑制NF-κB通路在一定程度上可以達(dá)到抑制炎癥和癌癥發(fā)生的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素可以通過這種作用而達(dá)到抑制胃癌的