乙?；閷У募倚QBm30K-3蛋白穩(wěn)定性機制及抗凋亡功能分析.pdf

1、蛋白質(zhì)乙?；揎検堑鞍踪|(zhì)上的賴氨酸殘基在乙酰基轉移酶的催化下，添加一個乙?；墓矁r修飾過程，是一種保守的蛋白質(zhì)翻譯后修飾機制。研究發(fā)現(xiàn)，組蛋白的乙?；?去乙?；c腫瘤的發(fā)生有著緊密的聯(lián)系。而隨著檢測技術的進步，非組蛋白的乙?；揎椧呀?jīng)越來越被人們所重視。研究乙?；揎棇Ψ墙M蛋白的影響已經(jīng)成為乙?；芯康闹髁?。大量研究表明，乙?；揎椖軌蚋偁幍鞍椎馁嚢彼岱核鼗稽c，抑制泛素介導的蛋白酶體降解途徑，從而提高蛋白的穩(wěn)定性，增加蛋白的細胞含量。

2、本課題前期研究通過乙?；亩胃患夹g和nano-HPLC/MS/MS鑒定了家蠶總蛋白的乙酰化位點。從鑒定數(shù)據(jù)中，我們發(fā)現(xiàn)Bm30K-3蛋白存在多個乙?；稽c。本課題主要開展乙?；揎棇m30K-3蛋白穩(wěn)定性的影響及其可能的分子機制研究。
　　首先，利用PCR的方法從家蠶cDNA文庫中擴增了Bm30K-3基因，將其克隆至pIEX-1多克隆位點后經(jīng)Sca Ⅰ單酶切再與pFastBacHT B單酶切回收產(chǎn)物連接獲得重組轉移載體pFas

3、tBacHT B-ie1-Bm30K-3，通過Bac-to-Bac系統(tǒng)構建獲得由極早期啟動子ie1驅動表達的重組家蠶桿狀病毒ie1-bacmid-Bm30K-3。Western Blotting結果分析表明，與His融合的目的蛋白His-Bm30K-3獲得成功表達。
　　隨后，我們分別使用去乙?；敢种苿㏕SA和乙酰化酶抑制劑C646上調(diào)及下調(diào)重組病毒ie1-bacmid-Bm30K-3感染BmN細胞的乙?；?，研究乙酰化水平變

4、化對細胞內(nèi)Bm30K-3蛋白含量的影響，結果表明：乙?；缴险{(diào)后Bm30K-3蛋白含量上升，且隨著乙酰化水平下調(diào)Bm30K-3蛋白含量也下降，表明乙?；梢陨险{(diào)Bm30K-3蛋白的細胞含量。為了進一步分析乙酰化對Bm30K-3含量變化影響的分子機制，我們使用蛋白質(zhì)合成抑制劑Cycloheximide（CHX）和蛋白酶體抑制劑MG132進一步處理TSA處理過的BmN細胞，通過對Bm30K-3降解曲線和累積曲線的分析，我們推測乙酰化通過影

5、響蛋白的泛素化水平來調(diào)控蛋白含量的變化。隨后，我們采用His抗體免疫沉淀獲得正常感染細胞與上下調(diào)乙酰化水平感染細胞中的Bm30K-3蛋白，經(jīng)Western Blotting檢測Bm30K-3乙酰化及泛素化水平，表明TSA處理后乙?；纳险{(diào)伴隨著蛋白泛素化水平的下調(diào)，即二者存在互作關系，進一步證明了上一步實驗的結論。綜合上述結果表明，Bm30K-3蛋白的乙酰化可能通過競爭蛋白的泛素化修飾，抑制泛素介導的蛋白酶體降解途徑，從而提高蛋白的穩(wěn)定

6、性，增加蛋白的細胞含量。
　　由于30K蛋白具有抗細胞凋亡的活性，我們建立了H2O2誘導的家蠶BmN細胞凋亡模型，研究Bm30K-3蛋白抗氧化應激誘導的細胞凋亡的作用以及乙酰化對其抗凋亡活性的影響。MTT法及Caspase-3/7檢測試劑盒檢測的結果表明，Bm30K-3蛋白可以在一定的程度上增強家蠶BmN細胞的活力，而且隨著轉染質(zhì)粒量的提高，BmN細胞的活性會有一定的提升，表明Bm30K-3蛋白同樣具有抗細胞凋亡的活性。隨后使用兩

7、種抑制劑TSA/C646研究Bm30K-3的乙?；綄ζ淇沟蛲瞿芰Φ挠绊?，結果顯示，乙?；缴险{(diào)后，Bm30K-3蛋白的抗凋亡能力提升，而乙酰化水平下調(diào)后，其抗凋亡能力下降，而且抗凋亡活性上下調(diào)的幅度差異較顯著，表明乙?；揎椌哂刑岣連m30K-3蛋白抗細胞凋亡的能力，結合前面的研究結果，推測其機制可能是由于乙?；揎椩鰪娏薆m30K-3蛋白的穩(wěn)定性并提高蛋白的細胞含量所致。本課題首次開展了家蠶Bm30K-3蛋白的乙酰化修飾功能研究