一種寡核苷酸介導的大腸桿菌基因敲除或點突變的方法.pdf

1、重組工程(Red/ET,recombination mediated genetic engineering)是指由重組酶催化的DNA片段之間的同源重組而在大腸桿菌中進行基因克隆或DNA改造的一種基因工程技術。重組工程在常規(guī)基因克隆方法難以進行或效率極低(如待克隆或修飾的DNA片段過大、合適的酶切位點難以尋找、凝膠回收難以進行等等,此時常規(guī)基因克隆方法難以進行或效率極低)時有著極大的優(yōu)勢。而且PCR擴增也可能引入錯配堿基、DNA片段經(jīng)紫

2、外線照射等操作也可能發(fā)生基因突變。重組工程則避免了這些煩瑣操作步驟,可實現(xiàn)高效的基因克隆和修飾,已逐漸成為常規(guī)的克隆手段。
　　 重組工程中的重組酶主要是來源自λ噬菌體三個基因,其中exo(Redα)編碼DNA5’端至3’端的外切酶Exo,其作用于雙鏈DNA分子而產(chǎn)生3’端突出的分子；bet(Redβ)編碼單鏈結合蛋白,其結合在由Exo作用而形成的DNA分子的3’突出端,同時還行使重組酶活性,即促進兩個單鏈、同源DNA分子之間的

3、退火；Gam基因編碼的Gam蛋白的作用是抑制大腸桿菌RecBCD對外源DNA的降解,這三個基因也就是通常意義上的重組酶基因。recA基因可增加重組的效率。
　　 由于重組工程可以短至36個堿基對的同源區(qū)域之間實現(xiàn)同源重組,就使得轉(zhuǎn)化線性雙鏈DNA至大腸桿菌而對其基因進行修飾成為可能。此線性雙鏈DNA而通過一步的PCR手段而一步獲得。
　　 本論文提供了一種通過寡核苷酸介導的重組工程手段來實現(xiàn)大腸桿菌的基因敲除和基因點突變

4、的方法。首先是通過重組工程將含有同源臂的蔗糖6-果糖轉(zhuǎn)移酶基因(sacB)和卡那霉素抗性基因(neo)的基因盒整合至待修飾的基因,含同源臂的sacB-neo基因盒由PCR獲得。再將含同源臂的寡核苷酸通過重組工程與基因組上的同源序列進行同源重組而將蔗糖6-果糖轉(zhuǎn)移酶基因和卡那霉素抗性基因去除,從而實現(xiàn)無任何堿基冗余的基因敲除和點突變。基因敲除的寡核苷酸設計與靶基因兩側的堿基序列一致,點突變的寡核苷酸則在寡核苷酸中引入需要突變的堿基。