含色氨酸的陽離子抗菌肽抗炎作用機制的研究.pdf

1、炎癥是革蘭氏陰性細菌外膜主要成分脂多糖(LPS)誘導產(chǎn)生的一種機體反應。長期以來抗生素的濫用不僅導致大量多藥耐藥細菌的產(chǎn)生，而且抗生素在體內(nèi)殺死細菌的同時，大量釋放LPS，進一步激發(fā)炎癥因子如IL-6、TNF-α等的釋放，造成機體二次傷害，導致膿毒癥的發(fā)生?？咕姆肿恿啃。灰桩a(chǎn)生耐藥性，還具有抗菌，抗腫瘤及抗炎等特點，是新發(fā)現(xiàn)的一種可代替?zhèn)鹘y(tǒng)抗生素的藥物。本實驗室以從中國林蛙皮膚分泌物中提取出的天然抗菌肽Temporin-1CEb為模

2、板設計合成了L-K6，并進一步在L-K6氨基端1、4、5、11和12位置通過氨基酸替換，合成一系列的含有Trp的抗菌肽I1W、14W、L5W、L11W、L12W、I1WL5W和I4WL5W。前期研究發(fā)現(xiàn)其具有很好的殺菌活性，并且?guī)?個凈正電荷，本研究以小鼠巨噬細胞RAW264.7為細胞模型，探究含色氨酸的陽離子抗菌肽抗炎作用機制。
　　首先測定含色氨酸的陽離子抗菌肽對小鼠巨噬細胞RAW264.7的細胞毒性，選取細胞存活率大于50％

3、的抗菌肽濃度10-20μM進行炎癥反應的實驗。其次用LPS誘導RAW264.7細胞炎癥因子TNF-α和IL-6的釋放，實驗結果顯示含色氨酸的陽離子抗菌肽對LPS誘導RAW264.7細胞炎癥因子TNF-α和IL-6的釋放都有一定的抑制作用，其中I1W、I4WL5W和L5W抑制效果最好，L-K6較差。實驗室前期研究結果表明這些含色氨酸抗菌肽抗細菌和抗腫瘤細胞的作用靶點是細胞膜，通過破壞細胞膜的通透性而殺死細菌或腫瘤細胞。為了進一步探究含色氨

4、酸的陽離子抗菌肽抗炎作用機制，我們選取了I1W、I4WL5W和L5W三種肽作為實驗材料，L-K6做陰性對照，通過PI染色、細胞跨膜電位和共聚焦實驗來探究這四種抗菌肽對RAW264.7細胞的細胞膜通透性的影響，結果顯示抗菌肽對細胞形態(tài)和細胞膜并沒有破壞作用，而是透過細胞膜進入細胞中。通過RT-qPCR和Western Blot檢測了抗菌肽對通路蛋白TLR4/MyD88/NF-κB mRNA表達量和p38/ERK/JNK蛋白表達量的影響。R

5、T-qPCR結果顯示:不同抗菌肽對通路蛋白mRNA表達量均有不同程度的抑制作用，其中對TLR4抑制效果最好的為I4WL5W，對MyD88和NF-κB抑制效果最好的為I1W， L-K6的抑制效果相對其他三種肽較弱。Western Blot結果表明:抗菌肽對通路蛋白表達也起到了不同程度的抑制作用。其中對p38和JNK抑制效果最好的為I4WL5W，對ERK抑制效果最好的為I1W，L-K6相對其他三種肽，對通路蛋白表達抑制效果最弱。