新型手性氮氧自由基對Alzheimer病的保護作用研究.pdf

1、目的:
　　阿爾茲海默病(Alzheimer's disease,AD)是老年期癡呆最常見的類型。認知能力的逐漸下降和淀粉樣斑塊及神經(jīng)原纖維纏結的出現(xiàn)是其典型的臨床病理特征。最終結果會導致腦功能的異常及神經(jīng)元凋亡。隨著我國人口老齡化的日益嚴重,AD越來越成為一個嚴重的社會問題。研究表明 AD神經(jīng)退行性病變過程中,氧化應激是除年齡外另一個重要因素。大量的研究表明DNA、RNA、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)氧化程度在AD病變過程中不斷升高,直至出現(xiàn)輕

2、度認知損傷,這些都說明氧化應激出現(xiàn)在 AD的早期階段,即發(fā)生在淀粉樣斑塊和神經(jīng)原纖維纏結之前出現(xiàn)。盡管在 AD的治療研究中有很多針對于對抗氧化應激介導損傷的神經(jīng)保護策略,但是臨床結果積極有效的只有很少一部分。
　　氮氧自由基(Nitroxide radicals, NRs)作為一類含有自旋單電子的穩(wěn)定的自由基化合物。早期被用作自旋示蹤劑。近來研究表明NRs還具有其特殊的生物學活性,一些NRs具有抗腫瘤、輻射和缺血再灌注損傷等功能。

3、它與有害自由基反應通過“催化劑量”方式進行,只需很少的劑量即可發(fā)揮高效、強效和長效的抗氧化活性。例如,NRs具有擬SOD的作用。它可以通過電子轉(zhuǎn)移的方式參與到細胞內(nèi)的線粒體的呼吸鏈式反應,非常快速的清除超氧陰離子自由基 O2.-。正是由于 NRs以催化方式分解不斷產(chǎn)生的有害自由基,反應過程中本身不會被消耗,可以循環(huán)再生利用,這也是其它自由基清除劑所無法比擬的。同時因其特有的自旋示蹤功能,可通過電子順磁共振或核磁共振成像實時了解其在組織中

4、的分布及變化反應。
　　正是由于NRs這些獨特的性質(zhì),我們推測其在AD的發(fā)病過程中會發(fā)揮很好的抗氧化的能力,起到預防、治療甚至是診斷AD發(fā)生的作用。因此,有望將NRs制備成新型的應用于神經(jīng)退行性疾病的抗氧化應激損傷的藥物。
　　方法:
　　在本實驗中,我們采用體外抗氧化模型,Aβ1-42誘導的細胞毒性損傷模型以及APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因AD鼠模型,來評價NRs的抗氧化能力及對AD的保護作用。
　　體外抗氧化實驗中,

5、我們分別采用光澤精誘導的發(fā)光體系、CHP誘導的脂質(zhì)過氧化模型和 F2-異前列素免疫試劑盒來評價 NRs清除超氧陰離子和抑制脂質(zhì)過氧化的能力;
　　體外培養(yǎng)原代皮層神經(jīng)元模型中,在培養(yǎng)到第10天的時候,分別給予10μM的姜黃素、Tempol和L-NNNBP,孵育24小時后,用25μM的寡聚態(tài)Aβ1-42處理12小時。換用原培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24小時后收集細胞。分別用 CCK-8試劑盒檢測細胞的存活率;用Tunel試劑盒檢測細胞的凋亡;用

6、3-NT的ELISA試劑盒測定組織的硝化應激水平;用陽離子熒光染料-四甲基羅丹明乙酯檢測線粒體的膜電位變化;用細胞的免疫熒光觀察激活的Caspase-3的變化;
　　最后采用APP/PS-1雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠來評價NRs的自由基清除能力和對AD的保護作用。實驗分為5組:姜黃素治療組、Tempol治療組、L-NNNBP治療組、WT組和TG組。藥物用飲用水溶解,終濃度均為1mM,WT組和TG組給予正常飲水。在小鼠6周時給予藥物處理,連續(xù)

7、給藥1個月。用Morris水迷宮實驗評價AD小鼠空間學習記憶能力;用剛果紅染色方法觀察Aβ斑塊;用蛋白免疫印跡方法觀察磷酸化Tau和GFAP蛋白含量變化;采用免疫組化方法觀察星形膠質(zhì)細胞的激活。
　　結果:
　　體外抗氧化實驗中,我們發(fā)現(xiàn)L-NNNBP較姜黃素和Tempol能顯著減少超氧陰離子和脂質(zhì)過氧化水平(＃P<0.05,＃＃P<0.01)。
　　培養(yǎng)皮層神經(jīng)元模型中,不同劑量的L-NNNBP對Aβ1-42誘導的細

8、胞毒性都有保護作用(*P<0.05,**P<0.01),且是濃度依賴的關系。單獨給予 L-NNNBP,沒有對細胞產(chǎn)生毒性作用。而Tempol的三種劑量都沒有觀察到神經(jīng)元的保護作用;姜黃素只有在高劑量(10μM)時有細胞保護作用。Tunel法檢測細胞凋亡的實驗中,相對于姜黃素(42.9％±3.1%)和Tempol(51.1%±1.1%),L-NNNBP高劑量(10μM)處理組,神經(jīng)元的凋亡顯著降低(22.7%±2.6%,*P<0.05,*

9、*P<0.01,＃＃P<0.01)。細胞免疫熒光結果說明L-NNNBP的這種抗凋亡的作用是通過降低激活型Caspase-3的表達引起的。Aβ誘導的氧化應激損傷也會造成線粒體功能障礙,影響線粒體正常膜電位,使其去極化。L-NNNBP能顯著降低TMRM+的密度,阻止線粒體膜的去極化,保護線粒體的正常功能,且其作用強度顯著高于姜黃素和 Tempol(＃P<0.05)。除了氧化應激,硝化應激也是自由基產(chǎn)生的主要來源。L-NNNBP三個濃度都降低

10、了3-NT的含量(**P<0.01),且抑制率顯著高于姜黃素和Tempol(＃P<0.05)。
　　Aβ斑塊的沉積是AD的主要病理癥狀之一。在APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因AD鼠模型中,6個月大的APP/PS-1小鼠給予L-NNNBP(1mM)1個月后,海馬和皮層的Aβ斑塊的沉積都顯著減少,并且效果強于姜黃素和Tempol(＃＃P<0.05)。除了Aβ斑塊沉積, AD的另一個病理特征就是Tau蛋白異常過度磷酸化后引起的神經(jīng)原纖維纏結。AP

11、P/PS1小鼠Tau蛋白的Thr205和Ser235兩個位點的磷酸化程度顯著升高。相對于WT組和其它藥物處理組,L-NNNBP顯著的降低了Tau蛋白在兩個位點的磷酸化程度(**P<0.01,＃P<0.05,＃＃P<0.05)。星形膠質(zhì)細胞的免疫組化和免疫蛋白印跡結果說明其在 AD發(fā)病的早期就被激活,有可能進一步誘導β-淀粉樣蛋白沉積加速和神經(jīng)纖維纏結形成。而 L-NNNBP在發(fā)揮抗氧化功效的同時抑制了星形膠質(zhì)細胞的激活。Morris水迷

12、宮的行為學結果也說明APP/PS1小鼠空間學習和記憶能力受到損傷,在給予 L-NNNBP治療后有顯著改善,并且效果強于姜黃素和 Tempol(**P<0.01,＃＃P<0.01)。
　　結論:
　　本研究證明,無論是在氧化損傷的體外模型,還是Aβ1-42誘導的細胞毒性損傷模型,或是APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因AD鼠模型中,新型的手性氮氧自由基L-NNNBP都表現(xiàn)出了令人興奮的結果。它能清除超氧陰離子、抑制脂質(zhì)過氧化、減輕Aβ1-4