骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療小鼠自身免疫性肝炎機(jī)制探討的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　自身免疫性肝炎(Autoimmune hepatitis，AIH)是一種病因不明的肝臟慢性炎癥性疾病。目前，AIH的治療主要是應(yīng)用免疫抑制劑如糖皮質(zhì)激素，它可單獨(dú)應(yīng)用也可與硫唑嘌呤聯(lián)合應(yīng)用，但這種治療方案的完全緩解率并不高，且長(zhǎng)期服藥存在較多副作用，因此迫切需要尋找和探討新的有效治療方法。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone-marrow-derived mesenchymal stem cells，BMMSCs)是來(lái)源于骨髓中

2、的一種多能干細(xì)胞，具有多方向分化的潛能及強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)作用，大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究證實(shí)BMMSCs對(duì)多種自身免疫性疾病都有很好的治療作用。本實(shí)驗(yàn)以刀豆蛋白A(Concanavalin A，ConA)誘導(dǎo)小鼠建立AIH模型，通過(guò)尾靜脈途徑移植氯甲基苯甲酰胺(Chloromethyl-benzamidodialkylcarbocyanine，CM-Dil)標(biāo)記的BMMSCs，觀察其在AIH中的治療效果，以及移植后細(xì)胞在肝組織內(nèi)存活、分布情況

3、，并對(duì)其可能的治療機(jī)制進(jìn)行探討，為臨床BMMSCs的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　材料和方法：
　　1.小鼠BMMSCs的分離、培養(yǎng)、鑒定及體外標(biāo)記采用全骨髓貼壁法體外分離C57BL/6小鼠的BMMSCs，并進(jìn)行傳代培養(yǎng)。采取第三代BMMSCs，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其細(xì)胞表型，并采用茜素紅染色鑒定其骨向分化能力，以油紅0染色鑒定其脂向分化能力。體外應(yīng)用CM-Dil熒光染料標(biāo)記第三代BMMSCs，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞標(biāo)記率。
　

4、　2.AIH模型小鼠的建立將C57BL/6小鼠隨機(jī)分為4組，分別為實(shí)驗(yàn)A、B、和C組及正常對(duì)照組。A組、B組和C組分別由尾靜脈注射ConA10mg/kg-1、15 mg/kg-1和20mg/kg-1，而正常對(duì)照組由尾靜脈注射等體積的磷酸鹽緩沖液。于注射后8h取血清檢測(cè)谷丙轉(zhuǎn)氨酶(Alanine aminotransferase，ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(Aspartate aminotransferase，AST)水平;取肝臟制作病理切片，

5、根據(jù)Knodell肝炎活動(dòng)指數(shù)評(píng)分系統(tǒng)對(duì)肝組織的炎癥程度作出評(píng)分;取實(shí)驗(yàn)組小鼠心、脾、肺等組織觀察有無(wú)炎癥反應(yīng)。
　　3.BMMSCs肝組織中的分布情況及對(duì)AIH的治療效果由尾靜脈注射移植CM-Dil標(biāo)記的BMMSCs，依據(jù)不同細(xì)胞量，將C57BL/6小鼠AIH模型組分為4組，尾靜脈輸注ConA，30min后移植CM-Dil標(biāo)記的BMMSCs。模型Ⅰ組、模型Ⅱ組、模型Ⅲ組和模型Ⅳ組移植的細(xì)胞量分別為1×105，5×105，1×10

6、6，1×107;而空白對(duì)照組尾靜脈輸注ConA，30min后注入等體積的磷酸鹽緩沖液。24h后處死小鼠，取血清標(biāo)本檢測(cè)ALT、AST及腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)、干擾素γ(Interferon-γ，IFN-γ)及白細(xì)胞介素(Interleukin-4，IL-4)的水平;取肝組織行病理檢查其炎癥程度并作出Knodell評(píng)分;取模型組心、肝、脾、肺組織在熒光顯微鏡下觀察切片組織熒光分布情況。

7、
　　結(jié)果：
　　1.小鼠BMMSCs原代培養(yǎng)在接種48h后可見(jiàn)貼壁細(xì)胞，培養(yǎng)到第三代細(xì)胞形態(tài)趨于統(tǒng)一，細(xì)胞排列呈束狀、漩渦狀或放射狀。流式細(xì)胞儀檢測(cè)BMMSCs的表面特異性抗原，結(jié)果顯示CD29、CD90呈陽(yáng)性表達(dá)，CD34呈陰性表達(dá);經(jīng)誘導(dǎo)后茜素紅染色、油紅0染色均呈陽(yáng)性，符合BMMSCs的特征。體外應(yīng)用CM-Dil熒光染料標(biāo)記第三代BMMSCs，24h后熒光顯微鏡下觀察可見(jiàn)CM-Dil標(biāo)記在細(xì)胞膜上發(fā)紅色熒光，且標(biāo)記率

8、達(dá)90％以上。
　　2.給以不同劑量的ConA后，A組、B組和C組血清ALT、AST的水平及Knodell評(píng)分均明顯高于對(duì)照組(P＜0.05)，且隨著ConA注射劑量的增加，上述各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)均有增高(P＜0.05)。實(shí)驗(yàn)組小鼠除肝組織病理可見(jiàn)肝損害，呈炎癥改變以外，心、肺、脾未見(jiàn)損傷。
　　3.BMMSCs移植治療后，模型Ⅳ組小鼠有4只死亡，其余各組小鼠未見(jiàn)死亡。24h后模型Ⅱ組、模型Ⅲ組小鼠血清ALT、AST的水平及Kno

9、dell評(píng)分均明顯低于空白對(duì)照組(P＜0.05);模型Ⅰ組與空白對(duì)照組之間比較上述指標(biāo)無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。模型Ⅱ組、模型Ⅲ組小鼠血清TNF-α、IFN-γ及IL-4的水平明顯低于空白對(duì)照組(P＜0.05);模型Ⅰ組與空白對(duì)照組之間比較上述指標(biāo)無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。熒光顯微鏡下在受損的肝組織內(nèi)可觀察到植入的BMMSCs，而在心、脾、肺等重要臟器并未觀察到標(biāo)記的BMMSCs。
　　結(jié)論：
　　1.小鼠的BMMS

10、Cs可采用全骨髓貼壁法在體外分離、培養(yǎng)、傳代、擴(kuò)增。新型熒光染料CM-Dil體外標(biāo)記BMMSCs，方法簡(jiǎn)單，標(biāo)記率高，可用于BMMSCs的體內(nèi)示蹤。
　　2.ConA誘導(dǎo)制作AIH小鼠模型簡(jiǎn)單易行，且組織損傷具有肝臟特異性，可以用于AIH的實(shí)驗(yàn)研究。
　　3.BMMSCs對(duì)ConA誘導(dǎo)的AIH小鼠模型有良好的治療作用。BMMSCs可以遷移到受損的肝組織，并通過(guò)減少TNF-α、IFN-γ及IL-4等炎癥因子的分泌而避免肝細(xì)胞的