間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合白藜蘆醇治療實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠的作用與機(jī)制研究.pdf

1、多發(fā)性硬化是以中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性脫髓鞘為特點的自身免疫性疾病，目前尚無安全有效的治療方法。實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠是研究多發(fā)性硬化常用的動物模型。白藜蘆醇是一種天然多酚類化合物，具有抗炎抗氧化特性，研究顯示其對多種自身免疫性疾病有治療作用。間充質(zhì)干細(xì)胞具有多向分化潛能、免疫調(diào)控和自我復(fù)制等特點，對多發(fā)性硬化有潛在的治療作用。我們通過探討間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合白藜蘆醇治療實驗性自身免疫性腦脊髓炎的作用和機(jī)制，為治療多發(fā)性硬化提供新的思路。本研

2、究分三部分，現(xiàn)將各部分內(nèi)容概述如下。
　　第一部分：白藜蘆醇對實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠血腦屏障完整性的影響
　　目的：研究白藜蘆醇對于實驗性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）小鼠的疾病進(jìn)程緩解的機(jī)制，探究白藜蘆醇對EAE小鼠的血腦屏障完整性的影響。
　　方法：使用8-10周齡的C57BL/6雌鼠實驗，將抗原MOG35-55用生理鹽水稀釋成5mg/ml，并按1:1等體積加入完全弗氏佐劑（其中結(jié)核桿菌H37Ra終濃度為4mg

3、/ml）混合，乳化后按每只0.1ml于小鼠脊柱兩側(cè)分四點皮下注射，第0h及第48h腹腔注射500ng0.5ml百日咳毒素（PTX），建立EAE小鼠模型。免疫在乙醚麻醉和充分固定下進(jìn)行。采用Knoz5分評分法對實驗小鼠臨床評分。通過50天觀察小鼠的臨床評分，來判斷EAE小鼠使用或者不使用不同劑量白藜蘆醇處理前后臨床評分情況。在免疫后21天通過小鼠尾靜脈注射伊文思藍(lán)染液后將小鼠腦組織速凍，切片拍照觀察腦部的完整性；通過免疫印跡技術(shù)檢測白藜蘆

4、醇處理后跨膜緊密連接蛋白ZO-1，occludin和claudin-5的表達(dá)情況。并同時檢測細(xì)胞間粘連分子ICAM-1和血管粘附蛋白VCAM-1的表達(dá)變化。利用實時定量PCR檢測促炎基因iNOS和IL-1、抗炎基因arginase1及NADPH氧化酶的表達(dá)；ELISA法檢測血清細(xì)胞因子IL-10水平。利用lucigenin實驗檢測NADPH氧化酶的活性，從而觀察白藜蘆醇對氧化壓力的緩解作用。
　　結(jié)果：
　　1、白藜蘆醇治療

5、能夠降低EAE小鼠的疾病嚴(yán)重性。在50天的觀察期內(nèi)，使用10 mg/kg的白藜蘆醇并不能抑制疾病的發(fā)生進(jìn)程，高劑量25mg/kg和50 mg/kg均能顯著的降低EAE的疾病嚴(yán)重性，使用25mg/kg和50 mg/kg的白藜蘆醇相對于PBS組的平均和最大臨床評分都顯著降低。
　　2、使用25mg/kg或是50mg/kg白藜蘆醇處理EAE小鼠與對照組相比，可以顯著的防止伊文思藍(lán)染液進(jìn)入腦部的量。而10mg/kg的白藜蘆醇效果與對照組沒

6、有顯著差異。
　　3、白藜蘆醇處理可以顯著改善EAE誘導(dǎo)的緊密連接蛋白的丟失。通過免疫印跡技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)ZO-1、occludin和claudin-5的表達(dá)在EAE小鼠中顯著降低，而使用25mg/kg或是50mg/kg白藜蘆醇可以顯著抑制ZO-1, occludin和claudin-5蛋白的丟失。
　　4、白藜蘆醇能夠抑制EAE小鼠腦組織中ICAM-1和VCAM-1蛋白的上調(diào)。免疫印跡結(jié)果顯示在EAE小鼠腦組織中ICAM-1和

7、VCAM-1蛋白表達(dá)顯著升高。而使用25mg/kg或是50mg/kg白藜蘆醇處理可以降低ICAM-1和VCAM-1蛋白的表達(dá)。
　　5、在EAE小鼠中促炎基因iNOS和IL-1顯著的升高，25mg/kg或是50mg/kg白藜蘆醇可以顯著抑制兩者的水平，而同樣在EAE小鼠中，局部的抗炎基因arginase1和細(xì)胞因子IL-10的表達(dá)輕微的上調(diào)，使用25mg/kg或是50mg/kg白藜蘆醇后可以顯著上調(diào)兩者的表達(dá)，而10mg/kg白藜

8、蘆醇并不影響這兩種分子的表達(dá)。
　　6、白藜蘆醇可以顯著抑制EAE小鼠NADPH氧化酶(NOX)的表達(dá)量和活性。EAE小鼠表達(dá)有升高的NOX1、NOX2和NOX4。白藜蘆醇的處理并不影響NOX1的表達(dá)，但是可以顯著抑制NOX2和NOX4的上調(diào)，用25mg/kg或是50mg/kg白藜蘆醇同樣也可以抑制EAE小鼠中NADPH氧化酶的活性。
　　第二部分：白藜蘆醇對間充質(zhì)干細(xì)胞在氧化應(yīng)激和炎癥環(huán)境的保護(hù)作用
　　目的：小鼠來

9、源的間充質(zhì)干細(xì)胞已經(jīng)被證明對實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠有一定的神經(jīng)保護(hù)作用，但是由于腦脊髓炎小鼠體內(nèi)的氧化應(yīng)激環(huán)境和炎癥環(huán)境容易影響間充質(zhì)干細(xì)胞的生物活性，進(jìn)而影響干細(xì)胞的治療效果。我們通過體外實驗探討白黎蘆醇對間充質(zhì)干細(xì)胞在這兩種環(huán)境下的保護(hù)作用。
　　方法：從6-8周齡的C57BL/6的腿骨中取出骨髓細(xì)胞，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，取第4代培養(yǎng)細(xì)胞用于實驗研究。使用抗Sca-1，CD14，CD34，CD44和CD45的抗體標(biāo)記，通過流式

10、細(xì)胞術(shù)鑒定從小鼠體內(nèi)提取的間充質(zhì)干細(xì)胞。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（mBM-MSCs）分別經(jīng)過20ng/ml的腫瘤壞死因子-α（TNF-α）或500mM的過氧化氫（H2O2）的處理，TNF在培養(yǎng)環(huán)境中持續(xù)存在；過氧化氫處理4小時。在體外培養(yǎng)的第1，3和5天MTT法測定細(xì)胞增殖和上清液乳酸脫氫酶（LDH）測定細(xì)胞損傷；應(yīng)用不同濃度的白藜蘆醇（0.1、1、10μmol/L）預(yù)處理mBM-MSCs，重復(fù)上述培養(yǎng)過程。
　　結(jié)果：
　　1、采

11、用貼壁持續(xù)培養(yǎng)的小鼠骨髓細(xì)胞經(jīng)流式抗體標(biāo)記，鑒定后確實帶有間充質(zhì)干細(xì)胞的表面標(biāo)記蛋白。
　　使用抗Sca-1，CD14，CD34，CD44和CD45的抗體標(biāo)記，通過流式細(xì)胞術(shù)鑒定出從小鼠體內(nèi)提取出的骨髓細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)6周后，分離出帶有間充質(zhì)干細(xì)胞表型的一群細(xì)胞亞群，而這群細(xì)胞主要是小鼠來源的間充質(zhì)干細(xì)胞。
　　2、白藜蘆醇能夠降低H2O2和TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性。通過MTT檢測細(xì)胞活性并檢測上清液LDH的泄漏表明，H2O2

12、（500 mM）或是TNF-α（20 ng/mL）能夠顯著降低細(xì)胞生存并升高LDH的泄漏。而白藜蘆醇能夠降低這種細(xì)胞毒性。
　　第三部分：間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合白藜蘆醇對實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠炎癥的影響
　　目的：研究間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合白藜蘆醇治療緩解EAE小鼠疾病進(jìn)程的機(jī)制，探究聯(lián)合治療對EAE小鼠炎癥的作用。
　　方法：通過觀察小鼠的臨床評分，來判斷EAE小鼠使用間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合白藜蘆醇處理的效果。通過H&E染色和抗

13、CD4的免疫組化檢測單核細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞對于脊髓組織的浸潤。利用ELISA檢測白藜蘆醇和間充質(zhì)干細(xì)胞處理后EAE小鼠血清中Th1型細(xì)胞因子IFN-γ/TNF-α和Th2型細(xì)胞因子IL-4/IL-10的表達(dá)量。
　　結(jié)果：
　　1、間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合白藜蘆醇治療能夠顯著降低EAE小鼠的疾病嚴(yán)重程度。使用白藜蘆醇聯(lián)合間充質(zhì)干細(xì)胞可以顯著的延緩EAE疾病進(jìn)程。間充質(zhì)干細(xì)胞或是白藜蘆醇治療后能夠顯著降低平均的臨床評分（PBS處理組中平

14、均臨床評分為2.63±0.42；mBM-MSCs處理組1.34±0.31；白藜蘆醇處理組1.44±0.38；PBS組與mBM-MSCs相比P<0.01；PBS組與白藜蘆醇處理組相比P<0.01）和最大臨床評分（PBS組3.76±0.32；mBM-MSCs處理組1.83±0.27；白藜蘆醇處理組1.74±0.31；PBS組與mBM-MSCs組相比P<0.01；PBS與白藜蘆醇組相比P<0.01）。而兩者聯(lián)用比單獨使用效果更好（聯(lián)用的平均臨

15、床評分0.64±0.27；mBM-MSCs組與聯(lián)用相比P<0.01；白藜蘆醇組與聯(lián)用相比P<0.01；聯(lián)用最大臨床評分0.91±0.22；mBM-MSCs組與聯(lián)用組相比P<0.01；白藜蘆醇處理組與聯(lián)用組相比P<0.01）。
　　2、間充質(zhì)干細(xì)胞和白藜蘆醇聯(lián)合使用可以降低EAE小鼠脊髓中的炎癥細(xì)胞數(shù)目。使用H&E染色和抗CD4的免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)EAE小鼠脊髓中的炎性單核細(xì)胞和T細(xì)胞的浸潤顯著升高，而單獨使用間充質(zhì)干細(xì)胞或是白藜蘆醇

16、與PBS組對比可以顯著降低浸潤細(xì)胞的數(shù)目（PBS組與mBM-MSCs處理組相比P<0.05；PBS組與白藜蘆醇處理組相比P<0.01），而間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合白藜蘆醇可以更加顯著的降低炎性細(xì)胞的浸潤（mBM-MSCs處理組與聯(lián)合治療組相比P<0.01；白藜蘆醇處理組與聯(lián)合治療組相比P<0.01）。
　　3、間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合白藜蘆醇能夠促進(jìn)EAE小鼠中Th1型向Th2型細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)變。在單獨使用間充質(zhì)干細(xì)胞或是白藜蘆醇處理的EAE小鼠中

17、Th1型細(xì)胞因子IFN-γ/TNF-α顯著的降低，而Th2型細(xì)胞因子IL-4/IL-10的表達(dá)量顯著升高（IFN-γ:PBS處理組與mBM-MSCs處理組P<0.01；PBS處理組與白藜蘆醇處理組相比P<0.01；TNF-α:PBS處理組與mBM-MSCs處理組相比P<0.01；PBS處理組與白藜蘆醇處理組相比P<0.01；IL-4:PBS處理組與mBM-MSCs處理組相比P<0.01；PBS處理組與白藜蘆醇處理組相比P<0.01；IL

18、-10:PBS處理組與mBM-MSCs處理組相比P<0.01；PBS處理組與白藜蘆醇處理組相比P<0.01）。而間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合白藜蘆醇治療后這種細(xì)胞因子轉(zhuǎn)換效果更加顯著。（IFN-γ:mBM-MSCs處理組與聯(lián)合治療組相比P<0.01；白藜蘆醇處理組與聯(lián)合治療組相比P<0.05；TNF-α:mBM-MSCs處理組與聯(lián)合治療組相比P<0.05；白藜蘆醇處理組與聯(lián)合治療組相比P<0.05；IL-4:mBM-MSCs處理組與聯(lián)合治療組相比P

19、<0.05；白藜蘆醇處理組與聯(lián)合治療組相比P<0.05；IL-10:mBM-MSCs處理組與聯(lián)合治療組相比P<0.01；白藜蘆醇處理組與聯(lián)合治療組相比P<0.01）。
　　結(jié)論：
　　1、白藜蘆醇可以顯著保護(hù)EAE小鼠的血腦屏障完整性。白藜蘆醇單獨使用可以有效降低EAE疾病的嚴(yán)重性，可以顯著的防止伊文思藍(lán)染液進(jìn)入腦部的量?？赡苁峭ㄟ^抑制緊密連接蛋白ZO-1、occludin和claudin-5的丟失，抑制EAE小鼠腦組織中上

20、調(diào)的粘附因子ICAM-1和VCAM-1蛋白，抑制EAE小鼠促炎基因iNOS和IL-1的表達(dá)，上調(diào)抗炎基因arginase1和細(xì)胞因子IL-10的表達(dá)，抑制EAE小鼠NADPH氧化酶的表達(dá)量和活性來實現(xiàn)。
　　2、 H2O2或是TNF-α模擬的氧化應(yīng)激和炎癥環(huán)境能夠顯著降低間充質(zhì)干細(xì)胞生存并升高LDH的泄漏。白藜蘆醇能夠降低H2O2和TNF-α誘導(dǎo)的對間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用。
　　3、間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合白藜蘆醇治療可以顯著的