內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞化療抵抗的機(jī)制及丹皮酚的逆轉(zhuǎn)作用.pdf

1、背景與目的:原發(fā)性肝癌是常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤,其死亡率占惡性腫瘤死亡率的第三位。在我國(guó)肝癌發(fā)病率及死亡率均呈上升趨勢(shì),己嚴(yán)重威脅著人們的生命與健康。目前手術(shù)仍是治療肝癌的首選方案,但多數(shù)患者就診時(shí)已屬中晚期,喪失了手術(shù)機(jī)會(huì),此時(shí)化療成為肝癌治療的重要手段,但療效很不理想。研究發(fā)現(xiàn),內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與腫瘤的關(guān)系甚為密切,是肝癌抗拒化療藥物的重要原因,因此研究?jī)?nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的化療抵抗的原因和調(diào)控機(jī)制,進(jìn)而通過(guò)特異性干預(yù)手段提高腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的

2、敏感性,對(duì)于提高治療效果,延長(zhǎng)患者生存期十分必要[19-21]。
　　從天然產(chǎn)物中尋求高效、低毒的新型抗肝癌藥物并深入探討其抗腫瘤機(jī)制是當(dāng)前國(guó)內(nèi)外研究的重要課題。丹皮酚(Paeonol, Pae)又稱牡丹酚,是我省道地中藥材毛莨科植物牡丹 Paeonia Suffruicosa Andr根皮和蘿摩科植物徐長(zhǎng)卿 Pycnostelma Paniculatum(Bunge) K. Schum干燥根或全草的主要有效成分,具有鎮(zhèn)靜催眠、解

3、熱鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)及保護(hù)心腦血管等廣泛的藥理活性。我們?cè)谇捌谘芯恐邪l(fā)現(xiàn),Pae對(duì)體內(nèi)外的多種腫瘤細(xì)胞的增殖有較強(qiáng)的抑制作用,此外,我們也發(fā)現(xiàn)Pae能增強(qiáng)順鉑對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2、SMMC-7721和人食管癌細(xì)胞Eca-109、SEG-1的增殖抑制作用。但丹皮酚是否可逆轉(zhuǎn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的化療抵抗中目前尚未報(bào)道,本研究首先探討了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在介導(dǎo)肝癌細(xì)胞對(duì)化療藥物抵抗中的作用及機(jī)制,并觀察了丹皮酚在逆轉(zhuǎn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的化療抵抗的作用,同時(shí)探討

4、其可能的作用機(jī)制,以期為肝癌的臨床治療提供新的方法。
　　目的:探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在肝癌細(xì)胞化療抵抗中的機(jī)制及丹皮酚的逆轉(zhuǎn)作用
　　方法
　　(1)采用MTT法觀察TM誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對(duì)阿霉素抑制HepG2肝癌細(xì)胞增殖的作用;采用流式細(xì)胞儀、TUNEL檢測(cè)法觀察TM誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對(duì)阿霉素誘導(dǎo)HepG2肝癌細(xì)胞凋亡的影響。
　　(2)Western-blot法觀察 TM誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對(duì) HepG2肝癌細(xì)胞 COX-

5、2,GRP78表達(dá)的影響;MTT、流式細(xì)胞儀、TUNEL法觀察COX-2選擇性抑制劑塞來(lái)昔布在TM誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)下對(duì)阿霉素抑制肝癌細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的影響;用Western-blot法觀察COX-2選擇性抑制劑塞來(lái)昔布和PI3K抑制劑LY294002對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的HepG2肝癌細(xì)胞COX-2, p-AKT,CHOP表達(dá)的影響;
　　(3)采用流式細(xì)胞儀、TUNEL法觀察丹皮酚在TM誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)下對(duì)阿霉素誘

6、導(dǎo)HepG2肝癌細(xì)胞凋亡的影響;用Western-blot法觀察丹皮酚對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的HepG2肝癌細(xì)胞COX-2,p-AKT,CHOP表達(dá)的影響。
　　結(jié)果
　　1.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在肝癌細(xì)胞對(duì)阿霉素敏感性中的作用
　　(1)采用MTT法,觀察衣霉素(Tunicamycin,TM)處理組、阿霉素處理組及TM預(yù)處理的阿霉素組對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞的增殖抑制作用。與阿霉素處理組相比,TM預(yù)處理的阿霉素組的細(xì)胞增殖抑制率明顯下降

7、。
　　(2)采用FCM和TUNEL法,觀察對(duì)照組、TM處理組、阿霉素處理組及TM預(yù)處理的阿霉素組對(duì)HepG肝癌細(xì)胞的凋亡。與阿霉素處理組相比,TM預(yù)處理的阿霉素組的細(xì)胞凋亡率明顯下降。提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生抵抗。
　　2.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞對(duì)化療抵抗的機(jī)制
　　(1)用Western-blot法觀察TM作用于HepG2肝癌細(xì)胞0h,4h,8h后 GRP78, COX-2的表達(dá)情況。結(jié)果表明,使

8、用 TM作用 HepG2肝癌細(xì)胞4h即可誘導(dǎo)GRP78表達(dá)的增多,提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的產(chǎn)生,并且 COX-2的表達(dá)隨時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增加。
　　(2)采用MTT法,觀察阿霉素處理組、TM預(yù)處理的阿霉素組及塞來(lái)昔布(50umol/L)+TM預(yù)處理的阿霉素組對(duì) HepG2肝癌細(xì)胞的增殖抑制作用。與阿霉素處理組相比,TM預(yù)處理的阿霉素組的細(xì)胞增殖抑制率明顯下降;與 TM預(yù)處理的阿霉素組相比,塞來(lái)昔布素+TM預(yù)處理的阿霉素組的細(xì)胞增殖抑制率明顯

9、升高。
　　(3)采用FCM和TUNEL法,觀察阿霉素處理組、TM預(yù)處理的阿霉素組及塞來(lái)昔布+TM預(yù)處理的阿霉素組對(duì) HepG2肝癌細(xì)胞凋亡的影響。與阿霉素處理組相比,TM預(yù)處理的阿霉素組的細(xì)胞凋亡率明顯下降;與 TM預(yù)處理的阿霉素組相比,塞來(lái)昔布+TM預(yù)處理的阿霉素組的細(xì)胞凋亡率明顯提高。提示抑制COX-2可逆轉(zhuǎn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的抵抗。
　　(4)用Western-blot和QRT-PCR法從基因和蛋白水

10、平觀察COX-2選擇性抑制劑塞來(lái)昔布對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激性凋亡蛋白CHOP的表達(dá)的影響,結(jié)果表明,使用 COX-2選擇性抑制劑塞來(lái)昔布可增加 CHOP的表達(dá),提示對(duì) CHOP的調(diào)控可能是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)COX-2產(chǎn)生化療抵抗的重要原因
　　(5)用 Western-blot法觀察 COX-2選擇性抑制劑塞來(lái)昔布對(duì) HepG2肝癌細(xì)胞PI3K/AKT表達(dá)的影響,結(jié)果表明,使用COX-2選擇性抑制劑塞來(lái)昔布可在抑制COX-2表

11、達(dá)的同時(shí),抑制p-AKT的表達(dá),同時(shí)用Western-blot法觀察PI3K抑制劑LY294002對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的HepG2肝癌細(xì)胞COX-2的表達(dá)的影響,結(jié)果表明,使用PI3K抑制劑LY294002對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的COX-2的表達(dá)無(wú)影響,提示COX-2可調(diào)控PI3K/AKT通路的表達(dá)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)使用PI3K抑制劑 LY294002也可在抑制肝癌細(xì)胞 HepG2 p-AKT的同時(shí),肝癌細(xì)胞的CHOP表達(dá)增多,提示抑制COX-2/

12、PI3K/AKT通路繼而調(diào)控CHOP的表達(dá)可逆轉(zhuǎn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的抵抗。
　　3.丹皮酚在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞對(duì)化療藥物抵抗中的作用
　　(1)采用FCM和TUNEL法,觀察阿霉素處理組、TM預(yù)處理的阿霉素組及丹皮酚(31.25mg/L)+TM預(yù)處理的阿霉素組對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞的凋亡的影響。與阿霉素處理組相比,TM預(yù)處理的阿霉素組的凋亡率明顯下降;與TM預(yù)處理的阿霉素組相比,丹皮酚(31.25mg/L)

13、+TM預(yù)處理的阿霉素組的凋亡率明顯提高。提示丹皮酚可逆轉(zhuǎn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的抵抗。
　　(2)用 Western-blot法觀察丹皮酚對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的HepG2肝癌細(xì)胞 COX-2, p-AKT,CHOP的表達(dá)的影響。結(jié)果表明,使用丹皮酚可抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的HepG2肝癌細(xì)胞的COX-2的表達(dá),同時(shí),在丹皮酚抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的COX-2的同時(shí),HepG2肝癌細(xì)胞 p-AKT的表達(dá)逐漸下降,并伴隨 HepG2肝

14、癌細(xì)胞的CHOP表達(dá)增多,與COX-2選擇性抑制劑塞來(lái)昔布和PI3K抑制劑LY294002作用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞 CHOP的表達(dá)結(jié)果相似。提示丹皮酚可能通過(guò)COX-2/PI3K/AKT通路上調(diào) CHOP的表達(dá)逆轉(zhuǎn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的抵抗。
　　結(jié)論
　　1.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能通過(guò)COX-2/PI3K/AKT通路調(diào)控CHOP的表達(dá)介導(dǎo)肝癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的抵抗。
　　2.丹皮酚可能通過(guò)COX-2/PI3K