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文檔簡介
1、目的:利用Marmarou大鼠中度創(chuàng)傷性腦損傷(TBI)模型,(1)探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)是否可以向TBI損傷灶中遷移、存活,并促進(jìn)TBI大鼠的神經(jīng)功能功能恢復(fù);(2)探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對TBI大鼠治療作用的機制,包括分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子、向神經(jīng)組織分化;(3)比較腦內(nèi)和靜脈兩種不同移植方法的治療效果有何不同。
方法:1.實驗動物及分組:120只SPF級雌性SD大鼠(鼠齡為10周,重約280±20g)被隨機分配入
2、4組,包括假手術(shù)組(shamgroup,n=30);腦創(chuàng)傷模型組(TBIgroup,n=30);腦內(nèi)移植組(intracerebraltreatmentgroup,n=30);靜脈移植組(intravenoustreatmentgroup,n=30)。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來自于SPF級雄性SD大鼠(鼠齡為3-4周),應(yīng)用貼壁篩選法分離SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,傳代、擴(kuò)增、純化,傳至第3代用于實驗。
2.模型制備和細(xì)胞移植:采用
3、改良Marmarou's法建立大鼠中度創(chuàng)傷性腦損傷2周、4周模型。腦內(nèi)移植組和靜脈移植組在傷后1天分別通過側(cè)腦室、尾靜脈注入約1×106個細(xì)胞,注入的液體量分別為10ul、0.5ml。
3.檢測指標(biāo)和方法:分別從每組大鼠中隨機取出10只,在傷后1周、2周、3周、4周進(jìn)行神經(jīng)功能損傷評分(mNSS)和轉(zhuǎn)棒儀測試。
每組中的其余大鼠分別于傷后2周、4周處死,應(yīng)用蘇木素-伊紅(HE)染色觀察腦組織形態(tài)學(xué)變化;免疫組
4、織化學(xué)方法檢測腦組織神經(jīng)生長因子(NGF)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)的表達(dá)及分布情況;Westernblot法檢測腦組織神經(jīng)生長因子、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的蛋白表達(dá)量的情況;激光共聚焦免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)檢測性別決定基因(Sry)、微管相關(guān)蛋白2(MAP-2)和神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白(GFAP),觀察雄性大鼠BMSCs在雌性TBI大鼠腦組織內(nèi)的分布及向神經(jīng)元、星型膠質(zhì)細(xì)胞的分化情況。
4.定量測定及統(tǒng)計方法:免疫組化陽性細(xì)胞陽性
5、度強弱用Image-ProPlus6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)半定量分析測定,以積分光度值(IOD)來表示。Westernblot蛋白定量分析用ImageJ圖像分析軟件分析測定,以目標(biāo)OD值與內(nèi)參OD值的比值來表示。實驗中所得結(jié)果數(shù)據(jù)均用(x)±s表示,應(yīng)用SPSS13.0forwindows統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析,以單側(cè)P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
結(jié)果:1.BMSCs的培養(yǎng)和鑒定:原代貼壁細(xì)胞以分散的集簇方式增
6、殖,大約10天后95%原代細(xì)胞融合,此時進(jìn)行傳代。傳代后細(xì)胞通過抑制期,生長迅速,以后每次傳代需要4-5天,細(xì)胞形態(tài)變得更為均一,呈紡錘形,細(xì)胞簇呈平行排列生長或漩渦狀生長。傳到第3代的BMSCs被移植入大鼠體內(nèi)。通過細(xì)胞的生長特性和形態(tài)鑒定其為BMSCs。
2.形態(tài)學(xué)檢測結(jié)果:HE染色光鏡下顯示假手術(shù)組皮層腦組織形態(tài)正常,血管管腔正常,管壁光滑,神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量多,排列規(guī)則,結(jié)構(gòu)完整,形態(tài)正常;創(chuàng)傷模型組可見不同程度的蛛網(wǎng)膜
7、下腔出血,廣泛皮層腦組織水腫,血管腔擴(kuò)大,毛細(xì)血管充血,神經(jīng)元胞體腫脹,排列紊亂,甚至胞體縮小變形,核固縮濃染;與創(chuàng)傷模型組相比,腦內(nèi)移植組和靜脈移植組腦組織的病理改變均有不同程度的減輕。
3.神經(jīng)運動功能檢測結(jié)果:假手術(shù)組大鼠兩項神經(jīng)運動功能檢測均表現(xiàn)正常;與假手術(shù)組相比,其余三組造模后所有相同時間點mNSS均升高,轉(zhuǎn)棒儀測試時間明顯縮短,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與創(chuàng)傷模型組相比,兩組BMSCs移植組大鼠在所有
8、相同時間點的mNSS均下降,轉(zhuǎn)棒儀測試時間均延長,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與靜脈移植組相比,腦內(nèi)移植組大鼠在2周、3周、4周時的mNSS較低,在第3周時,腦內(nèi)移植組比靜脈移植組轉(zhuǎn)棒儀測試時間延長,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
4.NGF免疫組化和Westernblot檢測結(jié)果:
NGF免疫組化陽性產(chǎn)物為棕黃色顆粒,定位于胞漿中,陽性細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則,廣泛分布于檢測組織的大腦皮層中。在假手術(shù)組神經(jīng)
9、細(xì)胞的胞漿中僅呈弱陽性表達(dá);其余三組大鼠造模后,在所有相同時間點所測陽性結(jié)果與假手術(shù)組相比,免疫反應(yīng)增強,陽性細(xì)胞數(shù)均明顯增多,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與創(chuàng)傷模型組相比,兩組BMSCs移植組大鼠在所有相同時間點所測陽性細(xì)胞數(shù)均明顯增多,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與靜脈移植組相比,腦內(nèi)移植組在所有相同時間點所測陽性細(xì)胞數(shù)均輕度增多,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
NGF為分子量32kD的蛋白。與NGF的
10、免疫組化檢測結(jié)果相似,假手術(shù)組僅有少量NGF表達(dá),且蛋白表達(dá)量在兩時間點無變化;腦創(chuàng)傷模型組和兩組BMSCs移植組NGF動態(tài)表達(dá)與免疫組織化學(xué)在各個時間點檢測結(jié)果相吻合,比較同免疫組化檢測,差異同樣有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與靜脈移植組相比,腦內(nèi)移植組在所有相同時間點所測蛋白表達(dá)量均輕度增多,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
5.BDNF免疫組化和Westernblot檢測結(jié)果:
BDNF免疫組化陽性產(chǎn)
11、物和NGF相似,同樣為定位于細(xì)胞胞漿中的棕黃色顆粒,陽性細(xì)胞呈圓形或橢圓形,廣泛分布于檢測組織的大腦皮層中。BDNF蛋白在假手術(shù)組神經(jīng)細(xì)胞的胞漿中僅微量表達(dá),免疫反應(yīng)性同樣不隨時間而發(fā)生變化;其余三組大鼠造模后,在所有相同時間點所測陽性結(jié)果與假手術(shù)組相比,免疫反應(yīng)增強,陽性細(xì)胞數(shù)均明顯增多,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與創(chuàng)傷模型組相比,兩組BMSCs移植組大鼠在所有相同時間點所測陽性細(xì)胞數(shù)均明顯增多,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05
12、);與靜脈移植組相比,腦內(nèi)移植組僅在2周時所測陽性細(xì)胞數(shù)輕度增多,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
BDNF為分子量27-34kD的蛋白。平均光密度分析發(fā)現(xiàn),假手術(shù)組僅有微量BDNF表達(dá),且蛋白表達(dá)量在兩時間點無變化;同樣,腦創(chuàng)傷模型組和兩組BMSCs移植組BDNF動態(tài)表達(dá)與免疫組織化學(xué)在各個時間點檢測結(jié)果相吻合,比較同免疫組化檢測,差異也有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);不同于免疫組化檢測結(jié)果的是,與靜脈移植組的比較中,腦
13、內(nèi)移植組在所有相同時間點BDNF蛋白表達(dá)量均輕度增多,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
6.免疫熒光雙標(biāo)染色結(jié)果
Sry陽性細(xì)胞胞核為FITC標(biāo)記的綠色熒光,MAP-2和GFAP陽性細(xì)胞胞漿為TRITC標(biāo)記的紅色熒光。假手術(shù)組和腦創(chuàng)傷模型組各個時間點均未見綠染的或紅染的陽性細(xì)胞;在兩細(xì)胞移植組各個時間點大鼠腦切片中,均可見綠染的Sry與紅染的MAP-2共定位,及綠染的Sry與紅染的GFAP共定位;與同組2周
14、腦切片相比,腦內(nèi)移植組和靜脈移植組4周的腦切片中綠染的Sry陽性細(xì)胞明顯減少,仍可見與紅染的MAP2和GFAP共定位;腦內(nèi)移植組各個時間點綠染的Sry陽性細(xì)胞數(shù)明顯比靜脈移植組多;在腦內(nèi)移植組4周腦切片中,可看到單獨存在紅染的MAP2陽性細(xì)胞,無綠染的Sry與其共定位;靜脈移植組4周腦切片可觀察到單獨存在紅染的GFAP陽性細(xì)胞,無綠染的Sry與其共定位;在靜脈移植組4周腦切片中,腦實質(zhì)和血管腔里仍可看到單獨綠染Sry而無分化紅染共定位的
15、BMSCs陽性細(xì)胞。
結(jié)論:1.通過側(cè)腦室和尾靜脈兩種途徑移植BMSCs治療大鼠創(chuàng)傷性腦損傷,BMSCs均可遷移入損傷灶內(nèi),至少存活4周,可分化成為神經(jīng)元和星型膠質(zhì)細(xì)胞,并促進(jìn)TBI大鼠的神經(jīng)功能恢復(fù)。
2.BMSCs對TBI大鼠起治療作用的機制可能是:自分泌和旁分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子NGF、BDNF;自身分化成為神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞;促進(jìn)內(nèi)源性前體細(xì)胞分化為神經(jīng)元和星型膠質(zhì)細(xì)胞。
3.從神經(jīng)功能恢復(fù)
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