mTOR信號通路在牛乳腺上皮細(xì)胞甘油三脂和脂肪酸合成中的作用.pdf

1、乳脂肪含量與組成是構(gòu)成牛奶重要營養(yǎng)品質(zhì)的主要物質(zhì)基礎(chǔ)之一。牛乳脂肪的主要成分是甘油三酯，乳腺細(xì)胞以細(xì)胞內(nèi)合成和胞外攝取兩種形式獲得脂肪酸并進(jìn)一步合成甘油三酯。乳脂合成過程受到乳腺細(xì)胞內(nèi)外營養(yǎng)因素和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控，其中哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(the mammalian target ofrapamycin，mTOR)信號通路起著重要的作用。奶牛乳腺炎是一種奶牛常見病，影響牛奶中甘油三酯含量和脂肪酸的組成，無乳鏈球菌(S.agalact

2、iae)是奶牛乳腺炎的重要病原體之一。本研究以奶牛乳腺上皮細(xì)胞為模型，研究在胰島素刺激條件下和無乳鏈球菌侵染時(shí)，細(xì)胞中甘油三酯和脂肪酸合成的變化情況，并對mTOR信號通路在其中所起作用進(jìn)行初步探討。
　　本實(shí)驗(yàn)通過乳汁分離法得到純化的奶牛乳腺上皮細(xì)胞，(1)通過抑制劑（rapamycin）和RNA干擾技術(shù)抑制mTOR信號通路活性，或過表達(dá)Rheb激活mTOR信號通路，western blot檢測甘油三酯合成關(guān)鍵酶的表達(dá)、ELISA

3、檢測甘油三酯含量以及軟質(zhì)酸、DHA的變化;(2)胰島素刺激奶牛乳腺上皮細(xì)胞，ELISA檢測甘油三脂含量變化，GC-MS檢測細(xì)胞內(nèi)37種脂肪酸含量的變化;(3)無乳鏈球菌侵染奶牛乳腺上皮細(xì)胞，ELISA檢測甘油三脂含量變化，GC-MS檢測細(xì)胞內(nèi)37種脂肪酸含量變化。
　　結(jié)果表明:(1) mTOR信號通路特異性抑制劑rapamycin顯著抑制奶牛乳腺上皮細(xì)胞的增殖(p＜0.01)、mTOR信號通路活性和甘油三脂合成關(guān)鍵酶DGAT1的

4、表達(dá);(2)100 nM rapamycin處理奶牛乳腺上皮細(xì)胞8h，軟脂酸、DHA和甘油三脂的含量都有明顯下降(p＜0.01);(3) Rheb基因轉(zhuǎn)錄后沉默，降低mTOR信號通路活性和甘油三脂合成關(guān)鍵酶Lipin1和DGAT1的表達(dá)，甘油三脂合成減少(p＜0.05);(4)過表達(dá)Rheb基因，增強(qiáng)mTOR信號通路活性和Lipin1和DGAT1的表達(dá)，甘油三脂合成增多(p＜0.01);(5)5 mg/ml胰島素刺激細(xì)胞12h，甘油三酯

5、合成量與對照組相比，有顯著性提高(p＜0.05)，rapamycin對這一過程有抑制作用;(6)胰島素誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)脂肪酸的合成;(7)短時(shí)間(2 h)無乳鏈球菌侵染細(xì)胞誘導(dǎo)甘油三酯合成和分泌(p＜0.01)，使脂肪酸的組成發(fā)生變化。
　　綜上所述，本實(shí)驗(yàn)證明mTOR信號通路在牛乳腺上皮細(xì)胞甘油三脂和脂肪酸合成中發(fā)揮正向調(diào)控作用，其機(jī)制可能是調(diào)控了合成過程中關(guān)鍵酶的表達(dá)。胰島素誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)甘油三酯和脂肪酸的合成，而無乳鏈球菌侵染則導(dǎo)致細(xì)