氧腈酶催化合成手性藥物中間體的研究.pdf

1、研究目的：手性α-氰醇作為手性源可以衍生得到手性α-羥基酮、α-羥基酸酯、β-羥基胺和α-氨基腈等諸多重要的藥用、農(nóng)用和精細(xì)化工產(chǎn)品的手性中間體。以氧腈酶為生物催化劑立體選擇性的催化合成手性α-氰醇，在形成新的C-C鍵的同時(shí)，產(chǎn)物的分子結(jié)構(gòu)中也被引入了手性。本論文以多種來(lái)源的氧腈酶為生物催化劑，催化生成在藥物合成中具有重要應(yīng)用價(jià)值的手性α-氰醇的藥用中間體；通過(guò)固定化技術(shù)對(duì)不同選擇性和不同結(jié)構(gòu)的氧腈酶進(jìn)行固定后使用，為氧腈酶的工業(yè)化應(yīng)用

2、打下基礎(chǔ)；探索新的氧腈酶源，尤其是從微生物中篩選在植物中含量相對(duì)較少的S-選擇性的氧腈酶，擴(kuò)大S-型氧腈酶的來(lái)源，以期在合成手性藥物中間體時(shí)，具有廉價(jià)易得的S-型氧腈酶可利用。 研究方法： 1.本研究選取的底物分別為：苯乙醛、5-苯并噻吩甲醛、3,4-亞甲二氧基苯甲醛、3,4-亞甲二氧基苯乙醛和3,4-亞甲二氧基苯丙酮。通過(guò)化學(xué)法合成出相應(yīng)的五種外消旋乙?；?氰醇和一種由3,4-亞甲二氧基苯甲醛與硝基甲烷反應(yīng)生成的相應(yīng)

3、外消旋乙酰化β-硝基醇。以上述產(chǎn)物為標(biāo)準(zhǔn)品探索合適的色譜條件，為準(zhǔn)確分析生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的ee值奠定基礎(chǔ)。 2.在含有檸檬酸緩沖液的IPE反應(yīng)體系中，以丙酮氰醇為HCN源，使用苦杏仁(PaHNL)、蘋(píng)果、櫻桃、枇杷和木瓜(CsHNL)五種R-選擇性的氧腈酶和橡膠(HbHNL)、木薯(MeHNL)兩種S-選擇性的氧腈酶為生物催化劑，分別催化五種底物的手性羥腈化反應(yīng)。以收率和ee值的高低為指標(biāo)，比較具有相同選擇性的氧腈酶轉(zhuǎn)化以上底物的能

4、力。 3.以HbHNL為催化劑，催化3,4-亞甲二氧基苯甲醛與硝基甲烷的縮合反應(yīng)，分別考察有機(jī)溶劑的種類(lèi)、緩沖溶液的濃度、pH值、緩沖溶液的百分含量和硝基甲烷的濃度對(duì)生物轉(zhuǎn)化的影響，確定該類(lèi)生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)的最佳反應(yīng)條件。 4.分別使用多醛基葡聚糖和EupergitC為固定化載體，與蘋(píng)果氧腈酶共價(jià)結(jié)合后，得到相應(yīng)的固定化酶。進(jìn)行三因素七水平的均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，研究不同條件下生成的多醛基葡聚糖對(duì)固定化酶活性的影響。探討Euperg

5、itC與蘋(píng)果氧腈酶結(jié)合時(shí)，緩沖溶液的pH值、濃度和EupergitC用量對(duì)固定化酶活性的影響。分別檢測(cè)兩種方法對(duì)蘋(píng)果氧腈酶固定化的牢固程度。使用5-苯并噻吩甲醛為底物，以收率和ee值的大小為指標(biāo)，對(duì)比固定化酶與游離酶在雙相和微水相反應(yīng)體系中的催化結(jié)果。探討底物分別被固定化蘋(píng)果氧腈酶循環(huán)催化的情況。 5.使用磁性微球?qū)bHNL進(jìn)行固定化，檢測(cè)HbHNL被固定化的牢固程度及放置時(shí)間對(duì)固定化酶活性的影響，探討固定化酶被循環(huán)使用的次數(shù)

6、，以3,4-亞甲二氧基苯甲醛為底物，以收率和ee值的大小為指標(biāo)，對(duì)比固定化酶與游離酶在雙相和微水相反應(yīng)體系中的催化結(jié)果，探討底物分別被磁性微球固定化HbHNL循環(huán)催化的情況。 6.以外消旋2-(苯并噻吩-5-基)-2-羥基乙腈為HCN的供體，以3,4-亞甲二氧基苯甲醛為底物，在磁性微球固定化HbHNL催化下，嘗試一次生物轉(zhuǎn)化得到兩種具有重要用途的手性α-氰醇。 7.從反應(yīng)體系pH值、酶制劑的種類(lèi)和用量、丙酮氰醇的用量等方

7、面探討3,4-亞甲二氧基苯丙酮被手性羥腈化時(shí)ee值低下的原因。 8.以苯乙酮為底物，優(yōu)化來(lái)源于木瓜氧腈酶(以前未見(jiàn)報(bào)道)的催化反應(yīng)條件，探討其催化一系列甲基酮底物手性羥腈化的能力。嘗試使用多種植物組織粗粉為催化劑，以苯甲醛為轉(zhuǎn)化底物，以期尋找到新的植物來(lái)源的氧腈酶。以多份土壤為待篩樣品，以扁桃腈為唯一碳源，從中篩選僅產(chǎn)S-型氧腈酶的微生物。 結(jié)果： 1.以ChiralcelOB-H(4.6×250mm，5μm)為

8、手性固定相，以不同體積百分比的正己烷和異丙醇溶液為流動(dòng)相，對(duì)五種外消旋乙?；?氰醇和一種乙?；?硝基醇進(jìn)行了較好的分離。 2.蘋(píng)果氧腈酶催化五種底物生物轉(zhuǎn)化的收率介于24-91％之間，催化生成R-型產(chǎn)物的ee值介于41-97％之間。HbHNL催化五種底物生物轉(zhuǎn)化的收率介于35-85％之間，催化生成S-型產(chǎn)物的ee值介于29-98％之間。 3.在含檸檬酸緩沖液(40％v/v，0.2M，pH7.5)的MTBE溶液(10m

9、L)中，當(dāng)加入的HbHNL量為200μL硝基甲烷與3,4-亞甲二氧基苯甲醛初始濃度分別為2.4M和0.3M時(shí)，20-25℃反應(yīng)24h后生物轉(zhuǎn)化的收率為71％，ee值為83％。 4.使用100kDa的葡聚糖、葡聚糖和高碘酸鈉的用量分別為1.2g和1.8g、反應(yīng)130min時(shí)制得的多醛基葡聚糖與1mL蘋(píng)果氧腈酶粗提液反應(yīng)，交聯(lián)后的固定化酶與游離酶相比保留了53％的酶活。循環(huán)催化苯乙醛羥腈化反應(yīng)10次也未見(jiàn)明顯的酶活喪失。循環(huán)催化5-

10、苯并噻吩甲醛、3,4-亞甲二氧基苯甲醛和3,4-亞甲二氧基苯乙醛的手性羥腈化反應(yīng)8次時(shí)，分別從不同的使用輪次開(kāi)始多醛基葡聚糖固定化酶的催化能力開(kāi)始有了顯著降低。在1.2M，pH5.0磷酸二氫鈉緩沖溶液中，以350mg的EupergitC與200μL蘋(píng)果氧腈酶粗提液反應(yīng)，制得的EupergitC固定化酶與游離酶相比保留了69％的酶活。循環(huán)催化3,4-亞甲二氧基苯乙醛的手性羥腈化反應(yīng)8次以上時(shí)，產(chǎn)物的ee值下降明顯。循環(huán)催化苯乙醛、5-苯并

11、噻吩甲醛和3,4-亞甲二氧基苯甲醛手性羥腈化反應(yīng)10次以上未見(jiàn)明顯的酶活降低。以上兩種固定化蘋(píng)果氧腈酶在0℃微水相體系中，表現(xiàn)出了比游離酶更高的轉(zhuǎn)化率和立體選擇性。 5.磁性微球固定化HbHNL，與游離酶相比酶活保留了44％。放置時(shí)間為60天后，固定化酶的活性降低至原游離酶活力的38％，相同條件下的游離酶在放置60天后，酶活降低至原來(lái)的17％。固定化酶與游離酶相比，在微水相和雙相反應(yīng)體系中反應(yīng)的收率無(wú)明顯變化，但立體選擇性則有不

12、同程度提高。在循環(huán)催化苯乙醛、3，4-亞甲二氧基苯甲醛和3,4-亞甲二氧基苯乙醛手性羥腈化反應(yīng)8次的過(guò)程中，均未見(jiàn)明顯的酶活喪失。循環(huán)催化5-苯并噻吩甲醛手性羥腈化反應(yīng)第6次時(shí)，ee值開(kāi)始下降顯著。 6.以磁性微球固定化HbHNL為催化劑，外消旋2-(苯并噻吩-5-基)-2-羥基乙腈為HCN供體，催化3,4-亞甲二氧基苯甲醛的手性羥腈化，反應(yīng)最終的體系中含有7％的(S)-2-(3，4-亞甲二氧基苯基)-2-乙酰氧基乙腈，ee值為

13、97％，體系中63％的2-(苯并噻吩-5-基)-2-羥基乙腈，ee值為27％。 7.以等物質(zhì)的量的丙酮氰醇為HCN供體、加入10g/L的磁性微球固定化HbHNL，在0℃微水相體系中，催化3,4-亞甲二氧基苯丙酮的羥腈化反應(yīng)，反應(yīng)80min時(shí)ee值達(dá)到83％。 8.新來(lái)源的木瓜氧腈酶在含18％的檸檬酸緩沖液(0.1M、pH4.0)的MTBE溶液中，具有最佳催化性能。對(duì)于苯乙酮和碳鏈少于7個(gè)碳原子的脂肪族甲基酮都具有良好的催

14、化結(jié)果，但對(duì)于體積較大的芳酮和碳鏈多于7個(gè)碳原子的脂肪族甲基酮催化效果較差甚至不能轉(zhuǎn)化。從土壤中篩選出一株僅產(chǎn)S-選擇性氧腈酶的菌株，菌株的歸屬待定。 結(jié)論及意義： 1.以合成手性藥物中間體—手性α-氰醇為目的，以多種來(lái)源、不同立體選擇性的氧腈酶為生物催化劑，對(duì)苯乙醛、5-苯并噻吩甲醛、3,4-亞甲二氧基苯甲醛、3,4-亞甲二氧基苯乙醛和3,4-亞甲二氧基苯丙酮五種底物的手性羥腈化反應(yīng)進(jìn)行了系統(tǒng)研究，總體上以蘋(píng)果氧腈酶和

15、HbHNL催化分別得到R-和S-型手性α-氰醇的立體選擇性最高。 2.首次對(duì)HbHNL催化3,4-亞甲二氧基苯甲醛與硝基甲烷的反應(yīng)進(jìn)行了研究，探索了最適反應(yīng)條件。 3.分別以多醛基葡聚糖和EupergitC為交聯(lián)劑和固定化載體，首次對(duì)蘋(píng)果氧腈酶粗蛋白進(jìn)行了較好的固定。不僅酶活保留較好，而且與游離酶相比固定化酶催化底物手性羥腈化的收率和ee值均有不同程度的提高。在循環(huán)使用的次數(shù)上，以EupergitC為載體的固定化酶要優(yōu)于

16、以多醛基葡聚糖為交聯(lián)劑的固定化酶。為蘋(píng)果氧腈酶的批量催化及工業(yè)化應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。 4.首次以磁性微球固定化法對(duì)HbHNL進(jìn)行了固定化研究，固定化的HbHNL仍然保留了較高的催化活性，循環(huán)使用性能良好。與游離酶相比固定化HbHNL催化底物的立體選擇性更高。為HbHNL的應(yīng)用提供了新的方便、價(jià)廉的固定化方法。 5.以外消旋2-(苯并噻吩-5-基)-2-羥基乙腈為HCN供體，以3,4-亞甲二氧基苯甲醛為底物，以磁性微球固定Hb