干細(xì)胞因子及其受體在兒童再生障礙性貧血發(fā)病機(jī)制中的作用研究.pdf

1、研究背景與目的：再生障礙性貧血(aplasticanemia,AA,簡稱再障)是多種因素引起的骨髓造血功能衰竭，是嚴(yán)重危害兒童身體健康的常見血液病。其可能的發(fā)病機(jī)制包括：原始造血干細(xì)胞缺陷、免疫介導(dǎo)的造血抑制、骨髓微環(huán)境障礙。自從1904年Chauffard首次提出再障的名稱后，人們便對(duì)其病因和其發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了不斷的探索。許多學(xué)者應(yīng)用體外造血細(xì)胞集落形成技術(shù)證明再障時(shí)骨髓各類型造血干/祖細(xì)胞均有明顯的減少或缺如，患者造血功能衰竭的程度與

2、骨髓中造血細(xì)胞的數(shù)量成正比，其CD34+細(xì)胞數(shù)和集落形成能力均明顯低于正常對(duì)照組，提示造血干細(xì)胞缺乏導(dǎo)致造血功能衰竭可能是再障發(fā)病的主要因素。然而，應(yīng)用免疫抑制劑如抗胸腺細(xì)胞或淋巴細(xì)胞球蛋白以及環(huán)孢霉素A治療時(shí)，其療效為50％-80％。近年來隨著免疫學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)及分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，其中最受矚目的是干細(xì)胞因子及其相應(yīng)受體c-kit。造血微環(huán)境是造血細(xì)胞賴以生長、分化、成熟的場(chǎng)所，它的和諧與一些細(xì)胞因子的調(diào)控密切相關(guān)，干細(xì)胞因子(SC

3、F)及其受體(C-kit)是作用于最早期的造血干細(xì)胞，調(diào)控著干細(xì)胞的分化及成熟。因此，推測(cè)干細(xì)胞因子及其受體可能與兒童再障的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。但目前為止，國內(nèi)外尚未見到這方面的研究報(bào)道。鑒于此，我們?cè)O(shè)計(jì)了本研究課題，共分三部分。 一、血漿可溶性SCF及c-kit受體水平與兒童再障的發(fā)病機(jī)制 1.材料和方法：本研究以再障患兒、正常足月新生兒臍血及正常兒童血漿作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，采用ELISA酶聯(lián)免疫雙抗體夾心法檢測(cè)其可溶性SCF及可

4、溶性c-kit受體的水平，可溶性c-kit(DIACLONE，F(xiàn)RANCE)批內(nèi)變異系數(shù)＜6％，批間變異系數(shù)＜7.9％。檢測(cè)的靈敏度為0.095ng/ml，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍為0.312-10.00ng/ml，線性相關(guān)系數(shù)R=0.98；可溶性SCF(R&D公司，美國)檢測(cè)靈敏度為9.0pg/ml，批內(nèi)變異系數(shù)＜4％，批間變異系數(shù)＜10.3％，雙對(duì)數(shù)坐標(biāo)作對(duì)數(shù)線形曲線范圍為31.2-2000pg/ml。操作步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。檢測(cè)儀為英

5、諾威生物技術(shù)有限公司的微電腦全自動(dòng)酶標(biāo)儀(SIGMA960，德國)，可溶性c-kit在波長為450nm處讀取吸光度(OD)值，SCF在450nm和630nm讀取吸光度(OD)值。以標(biāo)準(zhǔn)OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。所有數(shù)據(jù)均用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件包處理，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(-x±s)表示。各組間比較采用方差分析，以P＜0.05示差異具有顯著意義。血漿可溶性c-kit及SCF濃度與性別、年齡、病程及疾病嚴(yán)重程度間的關(guān)系，用相關(guān)分析方法判斷。 2.結(jié)

6、果：①可溶性SCF濃度測(cè)定結(jié)果：再障患兒SCF水平為(363.55±134.31)pg/ml，正常兒童對(duì)照組為(468.24±147.21)pg/ml，正常足月新生兒臍血血漿為(560.16±200.94)pg/ml，既正常足月新生兒臍血組＞正常兒童組＞再障兒童組。再障兒童組與正常兒童組比較，差異有顯著性(p＜0.05)，再障兒童組與正常足月新生兒臍血組比較，差異有顯著性(p＜0.01)，正常兒童組與正常足月新生兒臍血組比較，差異無顯著

7、性(p＞0.05)；②可溶性c-kit濃度測(cè)定結(jié)果：再障患兒組可溶性c-kit水平為(13.02±6.16)ng/ml，正常兒童對(duì)照組為(16.81±5.51)ng/ml，正常足月新生兒臍血組為(19.03±5.85)ng/ml，也既正常足月新生兒臍血組＞正常兒童組＞再障兒童組。再障兒童組與正常兒童組比較，差異有顯著性(p＜0.01)，再障兒童組與正常足月新生兒臍血組比較，差異有顯著性(p＜0.01)，正常兒童組與正常足月新生兒臍血組比

8、較，差異無顯著性(p＞0.05)；③血漿可溶性SCF及可溶性c-kit濃度測(cè)定結(jié)果相一致，均為正常足月新生兒臍血組＞正常兒童組＞再障兒童組。再障兒童組與正常兒童組比較，差異有顯著性，再障兒童組與正常足月新生兒臍血組比較，差異有顯著性，正常兒童組與正常足月新生兒臍血組比較，差異無顯著性。 3.結(jié)論：①再障患兒SCF水平低于正常兒童，提示再障患兒骨髓基質(zhì)細(xì)胞存在數(shù)量減少或質(zhì)的缺陷，造成了SCF分泌量的下降。SCF水平降低可能在兒童再

9、障發(fā)病機(jī)制中起一定作用；②再障患兒可溶性c-kit水平也低于正常兒童，提示可能由于再障患兒造血干/祖細(xì)胞總數(shù)量減少，導(dǎo)致可溶性c-kit受體生成減少所致，既再障患兒可溶性c-kit調(diào)節(jié)SCF的能力低于正常；③正常足月新生兒臍血血漿可溶性c-kit和SCF均高于再障兒童，支持正常足月新生兒臍血含有更多的造血干/祖細(xì)胞和增殖調(diào)控因子；④造血干/祖細(xì)胞增殖調(diào)控因子SCF與其相應(yīng)受體的可溶形式sc-kit在再障兒童、正常兒童、正常足月新生兒臍血

10、血漿的濃度相一致，支持可溶性c-kit是通過與SCF結(jié)合來調(diào)節(jié)或阻止SCF刺激造血細(xì)胞生長的能力。 二、造血干細(xì)胞因子SCF及其受體c-kit蛋白和mRNA表達(dá)水平與兒童再障的發(fā)病機(jī)制 1.材料和方法：收集再障患兒和正常對(duì)照兒童骨髓，同時(shí)記錄其臨床資料。采用密度梯度離心法分離出單個(gè)核細(xì)胞，涂片，固定，應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)和核酸分子原位雜交技術(shù)，分別檢測(cè)其骨髓單個(gè)核細(xì)胞(BMMNC)中SCF及c-kit受體蛋白及細(xì)胞內(nèi)mRNA

11、的表達(dá)情況，同時(shí)提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA并進(jìn)行PCR擴(kuò)增SCF和c-kit基因，測(cè)定再生障礙性貧血患兒與正常對(duì)照者造血干細(xì)胞因子(SCF)及其受體c-kitmRNA的表達(dá)水平。采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以α=0.05作為顯著性水準(zhǔn)。 2.結(jié)果：①再障患兒組SCF蛋白陽性表達(dá)率為22.03％，SCFmRNA陽性表達(dá)率為23.72％，RT-PCR檢測(cè)SCFmRNA的陽性表達(dá)率為21.4％，正常對(duì)照組SCF蛋白陽性表達(dá)率為4

12、1.17％，SCFmRNA陽性表達(dá)率為43.13％，RT-PCR檢測(cè)SCFmRNA的陽性表達(dá)率為42.4％，再障患兒組SCF蛋白及mRNA陽性表達(dá)率顯著低于正常對(duì)照組，并且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；②再障患兒SCF蛋白和mRNA的陽性表達(dá)率與患兒的性別、年齡及發(fā)病年齡等臨床因素?zé)o關(guān)(均有P＞0.05)。但SCF蛋白和mRNA的陽性表達(dá)與臨床分型有關(guān)，SAA組SCF蛋白和mRNA的陽性表達(dá)率明顯低于CAA組SCF蛋白和mRNA的陽性表

13、達(dá)率,二者差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；③再障患兒組c-kit蛋白陽性表達(dá)率為23.72％，c-kitmRNA陽性表達(dá)率為30.50％，RT-PCR檢測(cè)c-kitmRNA陽性表達(dá)率為30.4％，正常對(duì)照組c-kit蛋白陽性表達(dá)率為23.52％，c-kitmRNA陽性表達(dá)率為29.41％，RT-PCR檢測(cè)c-kitmRNA陽性表達(dá)率為39.4％，正常對(duì)照組雖然較再障患兒組略有升高，但無顯著性差異(P＞0.05)；④未發(fā)現(xiàn)再障患兒c-

14、kit蛋白和mRNA的表達(dá)與患兒的性別、年齡、發(fā)病年齡、臨床分型等臨床因素有關(guān)(均有P＞0.05)。 3.結(jié)論：①再生障礙性貧血患兒造血干細(xì)胞因子SCF蛋白和mRNA的表達(dá)水平均較正常對(duì)照有顯著性降低，且用免疫細(xì)胞化學(xué)和核酸分子原位雜交、RT-PCR三種方法檢測(cè)結(jié)果一致，確實(shí)說明再生障礙性貧血患兒存在SCF表達(dá)的異常，且是發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平的異常，進(jìn)一步提示SCF降低在兒童再障發(fā)病機(jī)制中起一定作用，再障兒童存在SCF/C-kit信號(hào)

15、轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的異常；②再障患兒c-kit受體蛋白和mRNA的表達(dá)水平較正常對(duì)照無顯著性差異，提示c-kit受體蛋白和mRNA的表達(dá)與兒童再生障礙性貧血的發(fā)病似乎無關(guān)，但其結(jié)構(gòu)是否有突變及功能是否有異常有待進(jìn)一步研究；③SAA組與CAA組SCF蛋白和mRNA的陽性表達(dá)率與正常對(duì)照組比較均明顯降低，但SAA組降低更明顯，進(jìn)一步證實(shí)了SAA與CAA為同一質(zhì)疾病，且SAA較CAA臨床癥狀更嚴(yán)重；④SCF在兒童再生障礙性貧血中具有良好的臨床治療應(yīng)用前

16、景。 三、c-kit受體基因與兒童再障發(fā)病機(jī)制的研究 1.材料與方法：收取再障患兒和正常對(duì)照兒童骨髓或外周血，采用密度梯度離心法分離出單個(gè)核細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，根據(jù)c-kit基因結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，設(shè)計(jì)出其外顯子9、11、13三對(duì)引物，并進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳，陽性表達(dá)的標(biāo)本再行聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染后掃描照相，分別采用凝膠圖象分析、SSCP技術(shù)及基因序列分析手段，比較再障患兒和正常兒童c-kit基

17、因外顯子結(jié)構(gòu)有無差異，為進(jìn)一步探討兒童再障的發(fā)病機(jī)制提供有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 2.結(jié)果：①c-kit基因外顯子9、11、13分別進(jìn)行基因擴(kuò)增后瓊脂糖凝膠電泳分析，再障兒童及正常對(duì)照兒童基因表達(dá)二者間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，陽性標(biāo)本行聚丙烯酰胺凝膠電泳及銀染后未見基因的泳動(dòng)異位及單鏈帶數(shù)目的增多和減少；②行基因測(cè)序后，結(jié)果顯示再障患兒C-Kit基因exon9、11、13的堿基序列與正常兒童相比無差異，與genebank中的基因

18、圖譜進(jìn)行比對(duì)[22]，exon9、11、13均未見堿基序列改變或堿基數(shù)目的增多、缺失等情況存在。 3.結(jié)論：再障患兒c-kit基因外顯子9、11、13無突變，基因測(cè)序后未發(fā)現(xiàn)基因結(jié)構(gòu)及序列的異常。提示兒童再障的發(fā)病機(jī)制可能不是由c-kit基因結(jié)構(gòu)改變引起。 以上結(jié)論表明：再生障礙性貧血兒童骨髓造血衰竭和全血細(xì)胞減少可能與患兒血漿中可溶性SCF和c-kit以及骨髓單個(gè)核細(xì)胞中的造血干細(xì)胞因子SCF蛋白和mRNA基因表達(dá)減少