P38 MAPK信號(hào)途徑在支氣管哮喘氣道炎癥中的作用及藥物的干預(yù).pdf

1、目的：(1)研究p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase,p38MAPK)信號(hào)途徑與支氣管哮喘(簡(jiǎn)稱哮喘)氣道炎癥的關(guān)系.(2)探討p-p38MAPK(磷酸化p38MAPK,p38MAPK的活化形式)蛋白表達(dá)量對(duì)趨化因了嗜酸性粒細(xì)胞趨化蛋白2(eotaxin-2)和細(xì)胞因了白介素8(IL-8)分泌的影響及eotaxin-2分泌的時(shí)間依賴性.(3)觀察地塞米松及布地奈德對(duì)氣道炎癥和

2、p-p38MAPK蛋白表達(dá)的調(diào)控.(4)研究中藥氧化苦參堿對(duì)p38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及哮喘氣道炎癥的影響. 方法：以卵白蛋白(OVA)致敏和激發(fā)建立小鼠哮喘模型.清潔級(jí),雄性BALB/c小鼠80只,4～6周隨機(jī)分為8組,每組10只:正常對(duì)照組(C)、哮喘6小時(shí)組(A6)、哮喘12小時(shí)組(A12)、哮喘24小時(shí)組(A24)、哮喘48小時(shí)組(A48)、布地奈德(BUD)組(B)、地塞米松(DXM)組(D)、氧化苦參堿(OM)組(O

3、).末次激發(fā)后,哮喘組分別在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)頸椎脫臼處死,C、D、B、O組分別在末次激發(fā)后24小時(shí)頸椎脫臼處死,留取支氣管肺泡灌洗液(BALF)及肺組織.BALF沉渣涂片進(jìn)行細(xì)胞分類計(jì)數(shù);酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELASA)測(cè)定BALF中eotaxin-2和IL-8濃度;光鏡、電鏡觀察肺組織病理變化;Western blot測(cè)定肺組織勻漿中p-p38MAPK蛋白的含量;免疫組化SP法測(cè)定肺組織中p-p38MAPK蛋白的表達(dá)量并觀察其表達(dá)位置.

4、 結(jié)果：1.BALF中細(xì)胞分類計(jì)數(shù):BALF中嗜酸性粒細(xì)胞百分比(EOS﹪)哮喘各組均高于C組[(O.72±0.76)﹪](P<0.01),以A24組[(8.22±2.34)﹪]最高,明顯高于A6組[(4.94±1.76)﹪]、A12組[(5.83±1.85)﹪]、A48組[(6.33±2.11)﹪](P<0.05或P<0.01);D組[(5.39±2:1.76)﹪]、B組[(5.72±1.95)﹪]、O組[(5.44+2.07)﹪]

5、均低于A24組(P<0.01),仙高于C組(P<0.01).中性粒細(xì)胞的百分比(Neu﹪)A6組[(8.38±3.30)﹪]、A12組[(8.33+4.39)﹪]、A24組[(8.77±2.45)﹪]、A48組[(8.33±2.19)﹪]間無(wú)顯著性差異(P>0.05),但均高于C組[(4.17±2.24)﹪](P<0.01);D組[(6.50±2.36)﹪]、B組[(6.61±2.78)﹪]、O組[(6.83+3.07)﹪]均低于A24

6、組(P<0.05),但高于正常對(duì)照組(P<0.05).各藥物干預(yù)組間EOS﹪和Neu﹪均無(wú)顯著性差異(P>0.05). 2.光鏡:小鼠肺組織切片HE染色,C組支氣管及血管周圍未見炎性細(xì)胞浸潤(rùn), 支氣管完整,管腔未見粘液栓;A6組可見到較明顯的血管周圍炎性細(xì)胞浸潤(rùn),A12組、A24組、A48組均可見支氣管及血管周圍的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),以Lym、EOS和Neu為豐,支氣管上皮多處斷裂,管腔內(nèi)大量粘液;D組、B組、O組上述改變程度不一,均

7、較哮喘組輕. 3.電鏡:電鏡下,C組顯示正常的肺泡隔和肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞,肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞表面微絨毛完整,支氣管纖毛上皮細(xì)胞排列整齊;各哮喘組顯示炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞變性、壞死、脫落,板層體空泡化,支氣管纖毛上皮排列稀疏或斷裂;藥物干預(yù)組上述改變程度不一,均較哮喘組輕. 4.各組小鼠BALF中eotaxin-2和lL-8的濃度:BALFd?eotaxin-2的分泌隨時(shí)間延長(zhǎng)濃度增加,在末次激發(fā)后24小時(shí)達(dá)高峰,其

8、后濃度有所下降.哮喘組濃度均高于C組[(9.65±4.25)pg/ml](P<0.05或P<0.01),以A24組濃度[(30.37a:8.59)pg/ml]NN,明顯高于A6組[(17.27±5.71)pg/m1]、A12組[(17.91±4.41)pg/ml]、A48組[(24.70±7.78)pg/ml](P<0.05或P<0.01);D組[(14.63±5.18)pg/ml]、B組[(15.98±3.84)pg/ml]、O組[(

9、15.03±5.00)pg/ml]濃度均低于A24組(P<0.01),但仍高于C組(P<0.05),各藥物干預(yù)組間無(wú)顯著性差異(P>0.05).IL-8濃度A6組[(61.56±11.69)pg/m1]、A12組[(57.67±12.45)pg/ml]、A24組[(56.63±14.17)pg/ml]、A48組[(56.23±10.40)pg/ml]均高于C組[(26.01±9.49)pg/ml](P<0.01),哮喘各組間無(wú)顯著性差異

10、(P>0.05);藥物干預(yù)組中D組[(42.64±16.39)pg/ml]低于A24組(P<0.05),而B組[(53.18±8.19)pg/ml]、O組[(45.43±15.32)pg/ml]與A24組無(wú)顯著性差異(P>0.05),但均高于C組(P<0.01),D組濃度低于B組、O組,但無(wú)顯著性差異(P>0.05). 5.各組小鼠p-p38MAPK蛋白免疫組化結(jié)果比較:A6組(0.120±0.026)、A12組(0.1454±

11、0.031)、A24組(0.1494±0.032)、A48組(0.126±+0.013)表達(dá)量明顯高于C組(0.041+0.013)(P<0.01),哮喘組問無(wú)顯著性差異(P>0.05).D組(0.0824±0.024)、B組(0.096±0.013)、O組(0.0894±0.019)p38MAPK蛋白活化量明顯低于A24組(P<0.01),高于C組(P<0.01),各藥物干預(yù)組間以D組濃度最低,但各組間無(wú)顯著性差異(P>0.05).

12、 6.Western Blot測(cè)得各組小鼠肺組織的p-p38MAPK光密度值:A6組(1.540±0.364)、A12組(1.695±0.265)、A24組(1.6504±0.236)、A48組(1.365±0.263)光密度值明顯高于C組(0.637±0.219)(P<0.01),以A12組、A24組為高,但各組間無(wú)顯著性差異(P>0.05);D組(1.110a±0.287)、B組(1.139a±0.185)、O組(1.0214

13、±0.248)光密度值明顯低于A24組(1.7064±0.246)(P<0.01),但高于C組(0.593±0.110)(P<0.05或P<0.01),各藥物干預(yù)組間無(wú)顯著性差異(P>0.05). 7.相關(guān)性分析: (1)肺組織勻漿中p-p38MAPK蛋白含量與BALF中eotaxin-2濃度呈正相關(guān).(2)肺組織勻漿中p-p38MAPK蛋白含量與BALF中IL-8濃度呈正相關(guān).(3)BALF中EOS﹪與eotaxin-2濃度呈

14、正相關(guān).(4)BALF中Neu﹪與IL-8濃度呈正相關(guān).(5)BALF中eotaxin-2濃度與IL-8濃度呈正相關(guān). 結(jié)論： (1)哮喘小鼠肺組織磷酸p38MAPK蛋白表達(dá)增多,出現(xiàn)了p38MAPK通路的激活.(2)哮喘小鼠BALF中趨化因子eotaxin-2及細(xì)胞因了IL-8的濃度升高,可能與p38MAPK通路的激活有關(guān),而上調(diào)eotaxin-2及IL-8的分泌也可能是該通路參與哮喘氣道炎癥的機(jī)制之一.(3)糖皮質(zhì)激素抑制哮