監(jiān)測(cè)人TCRαβT細(xì)胞CDR3譜系漂移、TCR基因重排方法的建立和初步應(yīng)用.pdf

1、目的 (1)建立監(jiān)測(cè)人TCRαβT細(xì)胞CDR3譜系漂移的免疫掃描譜型分析技術(shù)(immunoscopespectratypingtechnique)，分析正常人外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheralbloodmononuclearcell，PBMC)中TCRαβT細(xì)胞CDR3譜系的多態(tài)性和長(zhǎng)度分布；監(jiān)測(cè)活動(dòng)性慢性乙型肝炎(ChronicHepatitisB，CHB)、急性T淋巴細(xì)胞白血病(T-lineageacutelymphob

2、lasticleukemia，T-ALL)、外周造血干細(xì)胞(peripheralbloodstemcells，PBSC)移植前后患者PBMC中TCRαβT細(xì)胞CDR3譜系漂移情況，并鑒定T細(xì)胞株Jurkat的TCR分子特征。為感染、腫瘤、移植等疾病的細(xì)胞免疫應(yīng)答機(jī)制、診斷、治療研究提供新的思路與方法；為TCR二次重排(secondrearrangement)研究提供監(jiān)測(cè)TCR動(dòng)態(tài)變化的技術(shù)； (2)建立監(jiān)測(cè)人TCRαβT細(xì)胞TC

3、R基因重排的連接介導(dǎo)PCR方法(Ligation-Mediated-PCR，LM-PCR)；建立檢測(cè)人TCR重排過程中的主要調(diào)節(jié)蛋白“重組酶激活基因酶(RecombinationActivatingGene，RAG)”、“末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶(terminaldeoxynucleotidyltransferase，TdT)”、“Ku70&Ku80連接蛋白”mRNA表達(dá)的逆轉(zhuǎn)錄PCR(reversetranscript-polymera

4、sechainreaction，RT-PCR)方法，初步探討CHB和T-ALL患者外周TCRαβT細(xì)胞CDR3漂移和TCR二次重排的關(guān)系。為疾病中TCRαβT細(xì)胞應(yīng)答、耐受的可能新的機(jī)制研究提供基礎(chǔ)；為TCR二次重排研究提供可靠的監(jiān)測(cè)技術(shù)和有效的分析手段； (3)探討體外TCR二次重排和CDR3譜系漂移研究的可能技術(shù)平臺(tái)：在鑒定抗CD3×抗癌胚抗原(carcinomaembuoantigen，CEA)雙特異性抗體(bi-spec

5、ificantibody，BsAb)的生物學(xué)活性的基礎(chǔ)上，探討抗CD3×抗CEABsAb“拉近”CD3陽性T細(xì)胞CEA陽性腫瘤細(xì)胞時(shí)，T細(xì)胞活化的效應(yīng)機(jī)制，初步分析抗CD3×抗CEABsAb介導(dǎo)PBL活化抗腫瘤時(shí)TCRαβT細(xì)胞CDR3譜系分布，為體外研究T細(xì)胞活化機(jī)制、TCR分子特征、人工誘導(dǎo)TCR二次重排提供可能的思路與方法，同時(shí)為抗CD3×抗CEABsAb的潛在臨床應(yīng)用、雙功能分子的效應(yīng)和機(jī)制研究提供新的研究技術(shù)。 結(jié)論

6、 (1)建立的監(jiān)測(cè)人TCRαβT細(xì)胞CDR3譜系的免疫掃描譜型分析技術(shù)，是一種相對(duì)簡(jiǎn)便、可靠、靈敏度高的特異T細(xì)胞研究技術(shù)，可分析多克隆樣本中CDR3表達(dá)頻率的變化并篩選單/寡克隆增生的特異T細(xì)胞，通過測(cè)序和生物信息學(xué)分析，可初步闡明相應(yīng)克隆群T細(xì)胞的TCR分子特征，同時(shí)可監(jiān)測(cè)單克隆/多克隆樣本中CDR3的動(dòng)態(tài)變化，其監(jiān)測(cè)的是整個(gè)樣品中T細(xì)胞的組成信息，而且不需對(duì)樣本進(jìn)行體外擴(kuò)增等特殊處理，相比于四聚體檢測(cè)技術(shù)和ELISpot技術(shù)

7、有著一定的優(yōu)越性。T細(xì)胞CDR3譜型分析可用到感染、腫瘤、移植、自身免疫病等疾病的T細(xì)胞應(yīng)答機(jī)制、診斷、個(gè)性化治療中，同時(shí)結(jié)合四聚體檢測(cè)技術(shù)等可應(yīng)用于TCR二次重排研究和新T細(xì)胞表位疫苗篩選； (2)CHB患者PBMC中T細(xì)胞存在明顯單克隆性、寡克隆性增生和偏峰現(xiàn)象，單/寡克隆性增生T細(xì)胞α鏈和β鏈CDR3區(qū)有著不同的序列與結(jié)構(gòu)，提示T細(xì)胞免疫應(yīng)答參與CHB的發(fā)病過程，應(yīng)答T細(xì)胞的TCR的分子特征和HBV抗原及個(gè)體HLA的多樣性

8、相關(guān)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果將為CHB的免疫病理、特異T細(xì)胞相關(guān)的個(gè)性化治療、新的HBV抗原的T細(xì)胞表位疫苗的篩選提供新的方法與手段； (3)T-ALL患者PBMC中存在T細(xì)胞單克隆性、寡克隆性增生和偏峰現(xiàn)象，部分測(cè)序結(jié)果證實(shí)同一患者克隆性T細(xì)胞存在不同的CDR3序列和結(jié)構(gòu)。這些異常T細(xì)胞克隆群有可能是原發(fā)的“腫瘤T細(xì)胞”或“對(duì)腫瘤應(yīng)答/耐受的T細(xì)胞”，或是“克隆演化”的腫瘤T細(xì)胞。對(duì)T-ALL的PBMC的TCRα鏈和TCRβ鏈CDR3譜系進(jìn)

9、行分析，可為T-ALLs的發(fā)病機(jī)制、殘余病變的診斷提供基礎(chǔ)，同時(shí)進(jìn)一步確定腫瘤增生性T細(xì)胞的TCR分子特征，以其基因或蛋白結(jié)構(gòu)為治療靶點(diǎn)(腫瘤T細(xì)胞的特異性抗原，tumorspecificantigen，TSA)，研制相應(yīng)的特異性單克隆抗體、獨(dú)特型DNA疫苗、干擾RNA等手段對(duì)T-ALL進(jìn)行個(gè)性化治療提供思路與方法； (4)采用免免疫掃描譜型分析技術(shù)對(duì)T淋巴細(xì)胞株Jurkat的TCR基因進(jìn)行鑒定，并模擬出完整的JurkatTCR

10、三維結(jié)構(gòu)，將為TCR的二次重排模型的建立提供基礎(chǔ)；采用免疫掃描譜型分析技術(shù)對(duì)1例β-地中海貧血造血干細(xì)胞移植前、移植后及GVHD反應(yīng)時(shí)PBMC中TCRβCDR3譜型進(jìn)行監(jiān)測(cè)，證實(shí)建立的免疫譜型分析技術(shù)能動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)多克隆樣本中T細(xì)胞在多克隆和單/寡克隆間的轉(zhuǎn)變，為臨床移植的免疫重建評(píng)估、免疫排斥反應(yīng)的機(jī)制和針對(duì)特異反應(yīng)T細(xì)胞的防治、疾病中T細(xì)胞克隆消長(zhǎng)、TCR重排機(jī)制研究提供可行的方法； (5)根據(jù)TCRBD基因重排時(shí)形成的雙斷裂R

11、SS末端，建立起可靠的監(jiān)測(cè)人TCRαβT淋巴細(xì)胞正參與重排的LM-PCR方法；在2例T-ALLs的PBMC中檢測(cè)到BD25'和3'的RSS斷裂末端，提示T-ALLs可能和外周T細(xì)胞的二次重排相關(guān)。建立的LM-PCR技術(shù)可用于T細(xì)胞重排模型和相關(guān)疾病的機(jī)制研究； (6)初步建立起監(jiān)測(cè)RAG1、RAG2、Ku70、Ku80、TdTmRNA表達(dá)的RT-PCR方法，并通過測(cè)序鑒定，證實(shí)方法可靠，同時(shí)對(duì)不同樣本的檢測(cè)，提示RAG可能存在多

12、種不同的剪接形式(表達(dá)的復(fù)雜性)，這種異?？赡芎湍[瘤及非淋巴細(xì)胞的TCR/BCR重排密切相關(guān)。NHEJ中的這幾種主要調(diào)控蛋白的mRNA的RT-PCR方法，將為TCR異常重排和腫瘤、自身免疫病等的關(guān)系研究提供方法，同時(shí)為外周T細(xì)胞的TCR的二次重排模型的建立等提供基礎(chǔ)； (7)抗CD3×抗CEABsAb能介導(dǎo)CD3+細(xì)胞和CEA+腫瘤細(xì)胞之間的橋連，通過提高PBL分泌FasL和GranzymeB等介導(dǎo)PBL對(duì)LoVo和SW480產(chǎn)