系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者糖皮質(zhì)激素沖擊治療前后TCRβ鏈CDR3受體庫(kù)的特征和變化分析.pdf

1、目的：
　　采用Illumina Solexa高通量測(cè)序技術(shù)，探討系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus，SLE）患者大劑量糖皮質(zhì)激素沖擊治療前后三個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)（治療前、治療后第一個(gè)月、治療后第三個(gè)月），外周血T細(xì)胞TCRβ鏈CDR3受體庫(kù)的特征和變化。
　　方法：
　　1從遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腎病風(fēng)濕科住院患者中，根據(jù)美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)2011年修訂的SLE診斷標(biāo)準(zhǔn)和SLEDAI活動(dòng)指數(shù)評(píng)

2、分標(biāo)準(zhǔn)，遵從患者知情同意原則下，篩選2名SLE活動(dòng)期志愿患者。
　　22例SLE活動(dòng)期的志愿患者：Patient1（P1）；Patient2（P2），在糖皮質(zhì)激素沖擊治療前、治療后第一個(gè)月和治療后第三個(gè)月時(shí)，每次采集外周血量5ml，同時(shí)檢測(cè)患者外周血白細(xì)胞數(shù)量及抗核抗體譜水平。
　　3分離各外周血液樣本中單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC），分別提取各樣本的總 DNA。各

3、樣本序號(hào)命名為：P1-0：患者1治療前樣本；P1-1：患者1治療后一個(gè)月樣本；P1-3：患者1治療后三個(gè)月樣本；P2-0：患者2治療前樣本；P2-1：患者2治療后一個(gè)月樣本；P2-3：患者2治療后三個(gè)月樣本。
　　4按照人T細(xì)胞TCRβ鏈CDR3受體庫(kù)建庫(kù)原理，采用多重PCR技術(shù)對(duì)各樣本的總DNA CDR3區(qū)擴(kuò)增建庫(kù)，采用Illumina Solexa高通量測(cè)序技術(shù)分別測(cè)定這三個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)的TCRβ鏈 CDR3受體庫(kù)基因序列（建庫(kù)

4、和測(cè)序由美國(guó)華盛頓醫(yī)學(xué)院Adaptive Biotechnologies immunoSEQ完成）。
　　5 T細(xì)胞TCRβ鏈 CDR3受體庫(kù)的組成和特征分析：測(cè)序后所得各個(gè)樣本的序列轉(zhuǎn)化為FASTA格式（又稱Pearson格式，為核苷酸序列或氨基酸序列的格式），提交至IMGT/HighV-QUEST在線軟件，對(duì)上傳后得IMGT summary文件，分析各樣本T細(xì)胞TCRβ鏈 CDR3受體庫(kù)的克隆多樣性，TRBV、TRBJ基因家族

5、分布及CDR3區(qū)的特征變化等。
　　結(jié)果：
　　12例SLE志愿患者三個(gè)時(shí)間點(diǎn)血清抗核抗體水平：
　　P1-0：抗ds-DNA抗體(+++)、抗RNP/SM抗體（++）、抗SSA抗體（++）；
　　P1-1：抗ds-DNA抗體(+++)、抗RNP/SM抗體（++）、抗SSA抗體（++）；
　　P1-3：抗ds-DNA抗體(+++)、抗RNP/SM抗體（+++）、抗SSA抗體（+++）；
　　P2-0：

6、抗ds-DNA抗體(+)、抗RNP/SM抗體（-）、抗SSA抗體（-）；
　　P2-1：抗ds-DNA抗體(+++)、抗RNP/SM抗體（++）、抗SSA抗體（+）；
　　P2-3：抗ds-DNA抗體(++)、抗RNP/SM抗體（+++）、抗SSA抗體（-）。
　　2例SLE志愿患者三個(gè)時(shí)間點(diǎn)白細(xì)胞數(shù)目：
　　P1-0：WBC7.3×109個(gè)/L、P1-1：WBC4.7×109個(gè)/L、P1-3：WBC7.1×10

7、9個(gè)/L；P2-0：WBC5.8×109個(gè)/L、P2-1：WBC3.6×109個(gè)/L、P2-3：WBC7.9×109個(gè)/L。22例SLE志愿患者三個(gè)時(shí)間點(diǎn)，PBMC的總DNA，在瓊脂糖凝膠電泳圖上，每個(gè)樣本 DNA預(yù)測(cè)位置均出現(xiàn)清晰的條帶。樣本經(jīng)美國(guó)華盛頓醫(yī)學(xué)院 Adaptive Biotechnologies ImmunoSEQ檢測(cè)，六個(gè)樣品各個(gè)總DNA量達(dá)2ug以上，符合建庫(kù)和Illumina Solexa高通量測(cè)序要求。
　

8、　3六個(gè)樣本 T細(xì)胞 TCRβ鏈 CDR3高通量測(cè)序原始序列數(shù)：原始序列總數(shù)/總Productive序列數(shù)/獨(dú)特的CDR3序列數(shù)，分別是：P1-0：884760條/731401條/34130條； P1-1：1539362條/1268445條/38849條； P1-3：1654320條/1371381條/23553條；P2-0：1219887條/994323條/24527條；P2-1：811161條/660616條/22632條；P2-3

9、：979612條/794783條/32190條。
　　4六個(gè)樣本TCR CDR3受體庫(kù)克隆多樣性變化：
　　4.1六個(gè)樣本的反辛普森指數(shù)，數(shù)值分別是P1-0：393.0113；P1-1：423.7155；P1-3：346.8453；P2-0：1725.220656；P2-1：159.3978332；P2-3：495.7108618。
　　4.2六個(gè)樣本中出現(xiàn)高頻增殖克隆(Highly expanded clones，H

10、EC）為：P1-0：0.0440％；P1-1：0.0440%；P1-3：0.0637%；P2-0：0.0082%；P2-1：0.0442%；P2-3：0.0093%。
　　4.3 P1和P2在治療前后出現(xiàn)的CDR3區(qū)共同的高頻克隆增值序列：P1治療前后均存在且對(duì)應(yīng)不同的TRBV/TRBJ基因家族序列：CASSRTVSNQPQHF； CASSYNHEQYF；CASSVVGNTEAFF。P2治療前后均存在且對(duì)應(yīng)不同的TRBV/TRBJ

11、基因家族序列：CASSPRTSYEQYF。兩例SLE志愿患者在治療前后三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的高頻克隆增值序列中都存在共同的E-Q-Y氨基酸基序。
　　5六個(gè)樣本TCR CDR3受體庫(kù)克隆序列分析結(jié)果：
　　5.1六個(gè)樣本優(yōu)勢(shì)取用的TRBV家族：
　　P1在治療前后均是優(yōu)勢(shì)取用的家族有TRBV28、TRBV19、TRBV2，治療前、后沒(méi)有發(fā)現(xiàn)取用丟失和新出現(xiàn)的家族。P2在治療前后均是優(yōu)勢(shì)取用的家族有TRBV2、TRBV28、TRB

12、V20-1，而TRBV12-4、TRBV7-1為治療后第一個(gè)月新出現(xiàn)家族。兩例志愿患者三個(gè)時(shí)間點(diǎn)均優(yōu)勢(shì)取用TRBV28、TRBV2基因家族。
　　5.2六個(gè)樣本優(yōu)勢(shì)取用的TRBJ家族：
　　在治療前后均是優(yōu)勢(shì)取用的家族有TRBJ2-7、TRBJ1-1、TRBJ1-5、TRBJ1-2、TRBJ2-1。P2在治療前后均是優(yōu)勢(shì)取用的家族有TRBJ2-7、TRBJ1-1、TRBJ2-1、TRBJ1-2、TRBJ2-3。兩例SLE志愿

13、者三個(gè)時(shí)間點(diǎn)T細(xì)胞受體庫(kù)均優(yōu)勢(shì)取用TRBJ2-7、TRBJ1-1、TRBJ2-1、TRBJ1-2基因家族，都無(wú)TRBJ基因家族的取用丟失現(xiàn)象。
　　5.3六個(gè)樣本優(yōu)勢(shì)取用的TRBV-TRBJ家族配對(duì)：
　　P1治療前后均存在優(yōu)勢(shì)配對(duì)的是TRBV28-TRBJ1-5、TRBV28-TRBJ2-7、TRBV6-2-TRBJ2-7。P2治療前后均存在優(yōu)勢(shì)配對(duì)的是TRBV2-TRBJ2-7、TRBV28-TRBJ2-7。P1與P2治

14、療前后均有高頻配對(duì)家族TRBV28-TRBJ2-7。
　　5.42例SLE志愿患者T細(xì)胞CDR3長(zhǎng)度分布：P1在治療前后的CDR3長(zhǎng)度均是以12或13個(gè)AA長(zhǎng)度為主的鐘形分布。P2治療前和治療后一個(gè)月是以13個(gè)AA為主，在治療后一個(gè)月出現(xiàn)以11個(gè)AA的異常高取用，治療后三個(gè)月以11個(gè)AA為主，呈鐘形分布。5.52例SLE志愿患者治療前后樣本的CDR3區(qū)氨基酸均高頻取用以絲氨酸（S）為代表的羥基類、極性中性（親水性）氨基酸。

15、　　5.62例SLE志愿患者治療前后CDR3區(qū)的重疊結(jié)果：P1治療前后均重疊的序列數(shù)為1466條，P2治療前后均重疊的序列數(shù)為559條。
　　結(jié)論：
　　1在血清學(xué)檢測(cè)水平，兩例SLE活動(dòng)期患者治療后的各項(xiàng)臨床檢驗(yàn)學(xué)的指標(biāo)，出現(xiàn)好轉(zhuǎn)傾向，但是2例SLE志愿患者之間，每個(gè)SLE志愿患者不同時(shí)期的各T細(xì)胞TCRβ鏈CDR3受體庫(kù)的多樣性表現(xiàn)不一致，提示可能與自身反應(yīng)性T細(xì)胞的應(yīng)答程度相關(guān)。
　　2本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)SLE志愿患者

16、治療前、后TCRβ鏈CDR3受體庫(kù)中TRBV、TRBJ基因家族優(yōu)勢(shì)取用和配對(duì)，CDR3區(qū)長(zhǎng)度分布、氨基酸取用和重疊率的組成特征及動(dòng)態(tài)變化對(duì)比分析，獲得兩例SLE志愿患者治療前后三個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)外周血TCRβ鏈CDR3庫(kù)特征和變化的數(shù)據(jù)，提示其與SLE患者對(duì)大劑量糖皮質(zhì)激素沖擊治療的免疫應(yīng)答存在一定相關(guān)性，可為治療前、后患者T細(xì)胞應(yīng)答狀態(tài)和水平提供評(píng)估基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。
　　3實(shí)驗(yàn)從2例SLE志愿患者篩選到的高頻克隆增殖TCRβ鏈 CDR3氨