辣椒WRKY轉(zhuǎn)錄因子cDNA的分離與功能鑒定.pdf

1、辣椒(Capsicum annuum)和煙草(Nicotin tobacco)在生長(zhǎng)過程中經(jīng)常受到病害或者其它非生物環(huán)境因子的影響，病害或者環(huán)境危害常導(dǎo)致產(chǎn)量和品質(zhì)的降低甚至絕收，即使頻繁施用農(nóng)藥也難以奏效且易帶來環(huán)境污染。而強(qiáng)化抗逆機(jī)能，培育高抗品種是解決這些作物病害問題的根本技術(shù)對(duì)策。目前兩大頗具應(yīng)用前景的技術(shù)對(duì)策是通過代謝途徑工程或通過篩選高效誘發(fā)因子以提高植物植保素含量來提高作物抗逆水平。研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子對(duì)植物次生代謝起著十分

2、重要的調(diào)控作用，相對(duì)個(gè)別或少數(shù)幾個(gè)結(jié)構(gòu)基因而言，轉(zhuǎn)錄因子的基因工程更適合于植保素代謝遺傳改良的應(yīng)用。本研究著眼于了解辣椒響應(yīng)逆境脅迫的分子機(jī)制，從辣椒cDNA文庫(kù)中分離出四個(gè)推定的WRKY轉(zhuǎn)錄因子，分別對(duì)其進(jìn)行瞬間表達(dá)、細(xì)胞定位、熒光定量PCR分析和超表達(dá)功能分析，主要結(jié)果如下： 1.分離獲得四個(gè)推定的WRKY轉(zhuǎn)錄因子，分別為CaWRKY，CaWRKY2，CaWRKY3，CaWRKY5，生物信息學(xué)分析他們都含有保守的WRKY結(jié)構(gòu)

3、域和鋅指結(jié)構(gòu)，序列比對(duì)推測(cè)可能參與不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。 2.亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)四個(gè)推定的WRKY轉(zhuǎn)錄因子都能定位于細(xì)胞核，與軟件預(yù)測(cè)的結(jié)果相符，說明是核定位蛋白，具有轉(zhuǎn)錄因子的基本特征。 3.瞬間表達(dá)驗(yàn)證四個(gè)推定的WRKY轉(zhuǎn)錄因子與W盒的結(jié)合特性，發(fā)現(xiàn)WRKY蛋白能特異的與W盒結(jié)合，啟動(dòng)GUS基因的表達(dá)。 4.熒光定量PCR分析四個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)模式，CaWRKY受多種非生物脅迫和激素誘導(dǎo)，機(jī)械創(chuàng)傷和茉莉酸甲

4、酯(MeJA)強(qiáng)烈的誘導(dǎo)其表達(dá)，水楊酸(SA)，辣椒疫霉、鹽、紫外和低溫抑制其表達(dá)：CaWRKY2在鹽和低溫條件下變化不明顯，機(jī)械創(chuàng)傷、JA、SA、疫霉、紫外強(qiáng)烈誘導(dǎo)其表達(dá)；CaWRKY3在疫霉和紫外下強(qiáng)烈誘導(dǎo)，SA和JA也誘導(dǎo)其表達(dá)，機(jī)械損傷誘導(dǎo)微弱表達(dá)，鹽和低溫變化不明顯；CaWRKY5在機(jī)械損傷和JA強(qiáng)烈誘導(dǎo)其表達(dá)，SA誘導(dǎo)變化不明顯，疫霉、紫外和低溫抑制其表達(dá)，高鹽處理下有升高現(xiàn)象，但沒有很有規(guī)律的變化趨勢(shì)。 5.構(gòu)建了

5、四個(gè)基因的超表達(dá)載體，用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草，各獲得10個(gè)T0代超表達(dá)株系。CaWRKY超表達(dá)株系的T0代植株矮化，不易感病；CaWRKY2超表達(dá)株系的T0代側(cè)枝少，T1代植株對(duì)重金屬抗性增強(qiáng)，表明該基因介導(dǎo)了植物對(duì)非生物因子脅迫的防衛(wèi)反應(yīng)；CaWRKY3超表達(dá)部分T1代植株對(duì)高溫抗性增強(qiáng)，CaWRKY5的T0代和T1代對(duì)低溫有明顯的抗性。 上述研究初步明確了4個(gè)辣椒WRKY轉(zhuǎn)錄因子在非生物逆境脅迫抗性中的作用，并為進(jìn)一步開展其