中藥干預(yù)慢性阻塞性肺疾病氣道重塑的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究目的：本課題旨在應(yīng)用中藥葛根素、粉防己堿及西藥反應(yīng)停作用于大鼠慢性阻塞性肺疾病模型，通過研究其對(duì)COPD大鼠的支氣管厚度、支氣管粘膜下炎癥細(xì)胞浸潤、成纖維細(xì)胞等肺組織病理學(xué)變化和羥脯胺酸、腫瘤壞死因子-a、轉(zhuǎn)化生長因子-β1、SOD、ET-1等指標(biāo)，評(píng)價(jià)該三種藥物對(duì)COPD大鼠氣道重塑的作用并探討其作用機(jī)制，為中醫(yī)中藥在COPD的-臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。 研究方法：由南京市鼓樓醫(yī)院動(dòng)物房提供清潔級(jí)大鼠110只，雌雄不拘，體重

2、200±20g。隨機(jī)分為：正常對(duì)照組(I)、COPD疾病模型對(duì)照組(Ⅱ)按照中醫(yī)證型分為陰虛組、氣虛組和血瘀組Ⅲ：COPD疾病模型(氣虛證)+中藥治療組(粉防己堿為Ⅲ<,T>、葛根素為Ⅲ<,P>)；Ⅳ：COPD疾病模型(陰虛證)+中藥治療組(粉防己堿為Ⅳ<,T>，、葛根素為Ⅳ<,p>)；Ⅴ：COPD疾病模型(血瘀證)+中藥治療組(粉防己堿為Ⅴ<,T>、葛根素為Ⅴ<,p>)：Ⅵ：COPD疾病模型+反應(yīng)停組(即Ⅵ<,th>組)。 由

3、煙熏及氣道滴入LPS兩次，復(fù)制慢性阻塞性肺疾病大鼠模型，造模用時(shí)4周。用ELISA法測定肺泡灌洗液血清ET-1、TNF-α，肺泡灌洗液中IL-8的含量，生化法分別測定血清和支氣管肺組織羥脯胺酸含量，用黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性。取大鼠右下肺置于中性福爾馬林液中固定12小時(shí)以上，石蠟包埋、切片，常規(guī)HE染色，顯微鏡下在病理圖像分析儀上觀測支氣管粘膜下炎癥細(xì)胞浸潤、成纖維細(xì)胞數(shù)等情況，100μm-200μm的支氣管平滑肌厚度，以及100μ

4、m-200μm的肺小動(dòng)脈血管壁厚度。用ELISA法測定人肺纖維細(xì)胞上清液的TGF-β1表達(dá)，用免疫細(xì)胞熒光化學(xué)法測定NF-KB的活性。 結(jié)果： 1、葛根素組： (1)模型組的大鼠血清TNF-α(99.2±1 5.3 pg/ml)、ET-1(9.1 6±1.93pg/ml)、肺泡盥洗液IL-8含量(115.4±2 3.8 pg/ml)明顯高于正常組TNF-α(56.7±8.3 pg/ml)、ET-1(3.66±1.

5、35 pg/ml)、IL-8(41.2±11.0 pg/ml)有顯著差異，P<0.01；模型組大鼠肺組織勻漿SOD含量為(102.58±15.38kμ/g)，低于正常組(196.19±8.86k μ/g)有顯著差異，P<0.01；模型組的大鼠細(xì)支氣管粘膜下炎癥細(xì)胞數(shù)114.2±18.7個(gè)/3個(gè)視野，明顯多于對(duì)照組19.2±3.6個(gè)/3個(gè)視野有明顯差異，P<0.01；模型組的支氣管平滑肌厚度25.76±1.38μm，與正常組17.27±2

6、.28μm相比明顯增厚，有顯著差異，P<0.01；模型組的肺小動(dòng)脈壁厚度88.93±6.63μm，與正常組59.00±11.16μm相比，明顯增厚，有顯著差異，P<0.01。 (2)葛根素治療組血清ET-1、TNF-α以及肺泡灌洗液IL-8含量均較模型組明顯降低，差異有顯著性，P<0.05(血瘀治療組的ET-1含量明顯低于模型組含量，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P>0.05)；葛根素治療組肺組織勻漿SOD值較模型組明顯增高，差異有顯著性，P

7、<0.05；各治療組的粘膜下炎癥細(xì)胞數(shù)、支氣管平滑肌厚度等病理學(xué)指標(biāo)較模型組都有明顯改善，差異有顯著性，P<0.01，各治療組肺小動(dòng)脈壁厚度較模型組有明顯改善，P<0.05。葛根素氣虛組、陰虛組、血瘀組之間相比，差別無顯著性，P>0.05。 2、粉防己堿組： (1)辛莫型組肺泡灌洗液TNF-α(33.92±8.67pg/ml)、血清HYP(13.82±1.15μg/ml)、支氣管肺組織HYP(747.3±1 02.9μg

8、/g)與正常組的TNF-α(11.1 2±5.63pg/ml)、血清HYP(7.71±1.18 μg/ml)、支氣管肺組織HYP(454.0±86.5μg/g)相比有顯著差異，P<0.01。模型組大鼠的細(xì)支氣管粘膜下炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)129.7±21.0個(gè)/3個(gè)視野、成纖維細(xì)胞計(jì)數(shù)18.9±1.9個(gè)/3個(gè)視野，與正常組大鼠細(xì)支氣管粘膜下炎癥細(xì)胞數(shù)25.0±4.7個(gè)/3個(gè)視野、成纖維細(xì)胞數(shù)9.8±1.2個(gè)/3個(gè)視野相比有明顯差異，P<0.01。

9、模型組支氣管平滑肌厚度54.4±7.8μm，與正常組27.2±1.8μm相比，有顯著差異，P<0.01。模型組支氣管粘膜上皮TGF-β1相對(duì)含量0.457±0.047，與正常組0.213±0.034相比有顯著差異，P<0.01。 (2)各治療組(Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ)TNF-α含量明顯低于模型組含量，有差異性，P<0.05。各治療組血清及支氣管肺組織的HYP含量、細(xì)支氣管粘膜下炎癥細(xì)胞及成纖維細(xì)胞計(jì)數(shù)、支氣管平滑肌厚度明顯小于模型組支氣管

10、平滑肌厚度、支氣管粘膜上皮TGF-β1相對(duì)含量均明顯低于模型組，有顯著差異性，P<0.01。(3)各治療組(Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、)之間的各項(xiàng)指標(biāo)兩兩對(duì)比，都未見有明顯差異，P>0.05。 3、反應(yīng)停組：反應(yīng)停組的TNF-α含量、支氣管肺組織的HYP含量、細(xì)支氣管粘膜下炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)、成纖維細(xì)胞計(jì)數(shù)、支氣管平滑肌厚度、支氣管粘膜上皮TGF-β1相對(duì)含量明顯低于模型組，有差異性，P<0.05。 4、體外試驗(yàn)提示，粉防己堿能明顯減輕TG

11、F-β1在人肺纖維細(xì)胞中的表達(dá)，并隨濃度增加作用而加強(qiáng)，P<0.05；隨著時(shí)間延長，也逐漸減少，但統(tǒng)計(jì)學(xué)上無差異，P>0.05。人肺纖維細(xì)胞的NF-K B經(jīng)Tet處理后其免疫細(xì)胞化學(xué)顯色及活性明顯減少。但葛根素組上述結(jié)果不明顯，P>0.05。 結(jié)論： 1、血瘀是COPD的主要病機(jī)之一，治療上采用活血化瘀法；葛根素屬活血化瘀中藥，符合中醫(yī)理論和臨床實(shí)踐，故治療COPD療效確切。本實(shí)驗(yàn)中TNF-α、IL-8、ET-1、SOD

12、、支氣管粘膜下炎癥細(xì)胞數(shù)、支氣管及肺小動(dòng)脈厚度檢測中各個(gè)治療組的指標(biāo)(除血瘀組的ET-1外)均與模型組有顯著差異，表明葛根素對(duì)COPD大鼠模型具有抗炎、抗氧化的作用，能夠減緩COPD患者的氣道重塑，延緩或阻止COPD疾病的發(fā)展，對(duì)各證型沒有選擇性，對(duì)抑制人肺纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化生長因子的表達(dá)及NF-KB作用不明顯。 2、COPD發(fā)生發(fā)生過程中，可形成肺氣虧虛，痰飲內(nèi)停、心脈瘀阻的病機(jī)。粉防己堿中醫(yī)臨床應(yīng)用證明有祛濕利水化飲作用，并能擴(kuò)

13、張血管，治療COPD療效確切，符合中醫(yī)理論和臨床實(shí)踐。本實(shí)驗(yàn)中TNF-α、HYP、細(xì)支氣管粘膜下炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)、成纖維細(xì)胞、支氣管平滑肌厚度、支氣管粘膜上皮TGF-β1相對(duì)含量等測定均明顯小于模型組，有顯著差異性，證實(shí)粉防己堿對(duì)COPD模型有明顯的抗炎作用，能夠緩解COPD大鼠的氣道重塑，延緩COPD疾病的發(fā)展，對(duì)各證型之間沒有選擇性；并可降低人肺成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化生長因子的表達(dá)，抑制NF-KB的炎性活性，說明該藥對(duì)氣道重塑的作用是多途經(jīng)的