拓展邊緣性供肝應(yīng)用的臨床和實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、全文分為二部分： 第一部分：拓展邊緣性供肝應(yīng)用的臨床研究 隨著移植外科技術(shù)的日臻完善、器官保存方法的不斷改進(jìn)、新型免疫抑制劑的成功研制及移植免疫理論的不斷發(fā)展,器官移植已取得了巨大成就,成為挽救各類終末期臟器疾病的有效手段,創(chuàng)造了巨大的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益,其成就已為醫(yī)學(xué)界和社會(huì)所肯定.迄今全球已有近80萬病人接受了器官移植術(shù).臨床肝臟移植(LT)經(jīng)過40年的發(fā)展,已成為終末期肝病的唯一有效治療方法.如何選擇合適的邊緣性肝臟作

2、為供體,使其規(guī)范化并采取適當(dāng)措施減輕其損傷仍是器官移植醫(yī)師面臨的重要課題. 本研究主要著眼于供肝脂肪變性和冷缺血時(shí)問延長(zhǎng)兩方面來探討邊緣性供肝在我國(guó)是否有其應(yīng)用價(jià)值. 對(duì)象和方法： 1、研究對(duì)象 2003年1月到2005年9月,我單位連續(xù)實(shí)施了204例成人(年齡大于16歲)尸肝肝移植. 2、研究方法 供肝的脂肪變性程度通過有經(jīng)驗(yàn)的移植外科醫(yī)師在獲取和保存過程中的視診和觸診進(jìn)行判斷.如初步判

3、斷脂肪變性程度較為嚴(yán)重則行冰凍切片檢查,快速評(píng)估供肝脂肪變性程度.如為重度脂肪變性,則摒棄不用.脂肪空泡占據(jù)了細(xì)胞質(zhì)大部分空間,細(xì)胞核被擠到邊緣認(rèn)為是大泡性肝細(xì)胞脂肪變性.大泡性脂肪變性的分級(jí):Ⅰ級(jí),沒有脂肪變性;Ⅱ級(jí),輕度脂肪變性(<30﹪);Ⅲ級(jí),中度脂肪變性(30﹪-60﹪);Ⅳ級(jí),重度脂肪變性(>60﹪). 研究變量為:供體年齡、性別、供肝重量、供肝重量與供肝受體重量比(GRBW)、冷缺血時(shí)間,受體年齡、性別、體重、原發(fā)

4、疾病、移植前肝功能(總膽紅素[TB],谷丙轉(zhuǎn)氨酶[ALT],谷草轉(zhuǎn)氨酶[AST],凝血酶原時(shí)間[PT])及腎功能(肌酐[Scr],尿素氮[BUN]),移植前終末期肝病的評(píng)分(MELD評(píng)分),移植后肝功能及腎功能.移植前的數(shù)據(jù)在移植術(shù)前24h內(nèi)收集,移植后的肝功能和腎功能在移植后一周內(nèi)每日觀測(cè).所有病人均在門診常規(guī)隨訪.早期移植物功能不全(EAD)定義為術(shù)后2-7天內(nèi)至少出現(xiàn)以下一種情況:TB>10mg/dL,PT≥17s,肝性腦病.早期

5、腎功能不全(ERD)定義為術(shù)后一周內(nèi)出現(xiàn)SCr≥2md/dL和/或需要透析治療維持. 3、統(tǒng)計(jì)分析 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,P<0.05判定有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異. 結(jié)果： 供肝脂肪變性分布比例如下:非中重度脂肪變性組,(n=160;78.4﹪):中度脂肪變性組,(n=44;21.6﹪).肝移植術(shù)后1周內(nèi)肝腎功能動(dòng)態(tài)變化兩組間變化趨勢(shì)一致,1-7d兩組問變量比較無明顯差異.ALT和AST

6、術(shù)后1d最高,5d內(nèi)呈明顯下降趨勢(shì),5d后可基本恢復(fù)至正常水平;TB在術(shù)后1-2d達(dá)峰值,以后逐漸下降至較低水平; PT于3d后可基本恢復(fù)正常水平;SCr波動(dòng)于0.8-1.2mg/dL,呈小幅度變化;而BUN相對(duì)維持在較高水平.PNF發(fā)生率為0﹪.EAD、ERD,病人累計(jì)生存率及移植物累計(jì)生存率在兩組問均無顯著差異(P>0.05).59例病人(28.9﹪)接受CIT延長(zhǎng)供肝.肝移植術(shù)后1周內(nèi)肝腎功能動(dòng)態(tài)變化在CIT延長(zhǎng)組及CIT正常組間

7、變化趨勢(shì)相似,1-7d兩組問變量比較均無明顯差異.CIT延長(zhǎng)組的EAD發(fā)生率明顯高于CⅡ、正常組(30.4﹪vs.18.3﹪,P<0.05).病人累積生存率及移植物累積存活率在CIT延長(zhǎng)組均明顯差于CIT正常組(P均<0.05).中度脂肪變性合并CIT延長(zhǎng)組的EAD發(fā)生率明顯高于非中重度脂肪變性合并CIT正常組,病人生存率及移植物存活率均低于非中重度脂肪變性合并CIT正常組(P<0.05). 結(jié)論： 1.中度脂肪變性供肝

8、并不影響肝移植病人術(shù)后早期肝腎功能的恢復(fù),也不影響病人和移植物的存活率,可以安全的作為供肝系統(tǒng)的一部分. 2.CIT延長(zhǎng)供肝早期移植物功能不良的發(fā)生率高,且病人的生存率及移植物的存活率均顯著下降. 3.中度脂肪變性供肝合并冷缺血時(shí)間延長(zhǎng)時(shí)，對(duì)受體和移植物預(yù)后較差，應(yīng)當(dāng)常規(guī)丟棄。 第二部分:邊緣性供肝移植的實(shí)驗(yàn)研究 國(guó)外一些移植中心提出所謂邊緣性肝臟的概念,指一些處于邊緣應(yīng)用狀態(tài)的供體肝臟,如脂肪變性供肝、

9、酒精性肝病供肝、熱缺血或冷缺血時(shí)間延長(zhǎng)供肝以及年齡大于50歲的老年供肝等.先前的臨床研究已經(jīng)得出了僅僅中度脂肪變性供肝并不影響移植物功能及病人生存率,而合并冷缺血時(shí)間延長(zhǎng)供肝將顯著影響移植物及病人的結(jié)果.為了進(jìn)一步在前瞻性研究中證實(shí)這一結(jié)果,并深入研究其發(fā)生機(jī)制,從而探索邊緣性移植物的保護(hù)性干預(yù),減輕移植物損傷、提高聯(lián)合移植療效,我們開展了邊緣性供肝的實(shí)驗(yàn)研究. 目前引起矚目的保護(hù)性基因A20編碼7鋅指結(jié)構(gòu)蛋白,具有調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)

10、和免疫應(yīng)答,發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡和抗組織損傷的強(qiáng)大作用,其體外實(shí)驗(yàn)觀察到,多種炎癥刺激因子或細(xì)胞因子如TNFα、IL-1、 脂多糖等都能誘導(dǎo)A20表達(dá),其誘導(dǎo)依賴于核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的激活,同時(shí)又對(duì)NF-κB的激活起負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用,阻斷NF-κB的活化,抑制NF-κB依賴性的iNOS等一系列前炎性基因的表達(dá).我們利用基因組學(xué)研究通過比較觀察脂肪變性供肝、脂肪變性合并冷缺血時(shí)間延長(zhǎng)供肝和正常供肝大鼠在移植后不同時(shí)點(diǎn)A20的表達(dá),探討邊緣性供

11、肝對(duì)移植物功能及生存率的影響機(jī)制. 材料與方法: 1.動(dòng)物模型 1.1大鼠脂肪變性模型的建立 健康成年雄性Lewis大鼠喂養(yǎng)膽堿.蛋氨酸缺乏飼料后6W后隨機(jī)挑選5只處死檢測(cè),觀察脂肪變性程度,并檢測(cè)肝臟組織中GSH、MDA、MPO指標(biāo).1.2大鼠原位肝移植模型的建立 采用本單位改良的Kamada-Calne方法行大鼠原位肝移植.2.動(dòng)物模型分組 采用雄性Lewis大鼠分別作為供體和受體,共

12、分成3組:脂肪變性供肝移植組(Steatotic donor liver group,S組),脂肪變性+冷缺血時(shí)間延長(zhǎng)(6h)供肝移植組(Steatotic+prolonged cold ischemia time donor liver group,SPC組),正常供肝移植組(normal donor group,N組).3. 生存率觀察,根據(jù)以上分組分別設(shè)立生存率觀察亞組:(Ss組、SPCs組、Ns組).4. 標(biāo)本采集:各組大鼠

13、分別于再灌注后24、48、72h處死,取材檢測(cè).5. 生化學(xué)檢測(cè):大鼠血清生化檢測(cè).6.肝組織谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)、髓過氧化物酶(MPO)檢測(cè).7.肝臟病理組織檢查:光學(xué)顯微鏡及電子顯微鏡下觀察組織學(xué)變化.8.末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端生物素標(biāo)記法(TUNEL)檢測(cè)凋亡.9. 肝臟內(nèi)保護(hù)性基因A20 mRNA的逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測(cè)10.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)

14、計(jì)學(xué)處理,P<0.05判定有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異. 結(jié)果: Ss組、SPCs組和Ns組大鼠的7天存活率分別為70﹪、40﹪和90﹪,Kaplan-Meier生存率曲線顯示Ns組大鼠的存活率明顯高于SPCs組(P<0.05),而Ss組與SPCs組比較或于Ns組比較均無顯著差異(P>0.05).受體大鼠ALT、AST和TB等肝功能指標(biāo)均在移植后72h內(nèi)不斷升高.與其他兩組相比,SPC組肝功能指標(biāo)處于較高水平.與N組相比,移植后24h,

15、SPC組ALT顯著高(P<0.05);移植后48h,SPC組AST、TB值顯著高(P<0.05);移植后48h,SPC組ALT、AST、TB值顯著高(P<0.05).S組與N組移植后3個(gè)時(shí)點(diǎn)的肝功能指標(biāo)未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05).24h時(shí)點(diǎn)SPC組GSH明顯高于N組(P<0.05),S組MDA明顯高于N組(P<0.05),48h時(shí)點(diǎn)的SPC組MDA明顯高于N組(P<0.05).24h時(shí)點(diǎn)SPC組及N組GSH均明顯高于S組(P<0.0

16、5).S組和SPC組各時(shí)點(diǎn)出現(xiàn)嚴(yán)重的小梁結(jié)構(gòu)破壞,肝竇擴(kuò)張,肝細(xì)胞腫脹變性,尤以SPC組為重,N組大鼠術(shù)后各時(shí)點(diǎn)小梁結(jié)構(gòu)無殊,細(xì)胞形態(tài)基本正常.N組大鼠肝臟細(xì)胞凋亡少,S組大鼠肝臟可見少量凋亡小體,多于N組.而SPC組大鼠肝臟內(nèi)可見大量凋亡細(xì)胞.移植后24h,N組大鼠肝臟內(nèi)即有A20的表達(dá),而S組和SPC組大鼠肝臟內(nèi)無表達(dá);移植后48h,N組大鼠肝臟內(nèi)A20表達(dá)強(qiáng),S組大鼠肝臟內(nèi)A20有表達(dá),而SPC組表達(dá)弱;移植后72h,3組大鼠肝臟