肝螺桿菌的分離鑒定及其與腸道炎癥性疾病的相關(guān)性研究.pdf

1、研究背景/目的： 螺桿菌是一類微需氧條件生長，營養(yǎng)要求高的革蘭染色陰性螺旋狀細(xì)菌，主要定植在宿主胃腸道微環(huán)境，肝膽系統(tǒng)，引起組織炎癥，甚至腫瘤發(fā)生。近年來，隨著越來越多的螺桿菌成員不斷從人，動物的胃，肝腸組織中被分離發(fā)現(xiàn)，除了以幽門螺桿菌(Helicobacterpylori，H.pylori)為代表的胃內(nèi)螺桿菌與人胃炎，胃十二指腸潰瘍，胃癌，胃粘膜相關(guān)淋巴組織(mucosa-associatedlymphoidtissue，M

2、ALT)淋巴瘤發(fā)生相關(guān)已得普遍認(rèn)同外，肝腸螺桿菌(enterohepatichelicobacterspecies，EHS)的研究也引起國內(nèi)外學(xué)者的日益關(guān)注，雖然動物是大部分螺桿菌的自然宿主，然而實驗表明EHS感染不同品系免疫缺陷動物可引發(fā)宿主不同程度的免疫反應(yīng)從而導(dǎo)致肝膽道炎，盲結(jié)腸炎，甚至腫瘤的發(fā)生，其中肝螺桿菌(Helicobacterhepaticus，H.hepatitus)是目前研究較多的EHS，也是又一明確證實的致癌原。此

3、外，隨著國外陸續(xù)報道從人體內(nèi)分離培養(yǎng)及檢測到EHS感染，因此EHS與人肝腸疾病的發(fā)生是否有著直接或間接的致病作用逐漸成為新的研究方向。而我國在EHS方面的研究還尚未開展，本課題旨在從初步研究了解H.hepaticus開始，率先開展EHS的國內(nèi)研究，可能為人類炎癥性疾病的病因?qū)W提供依據(jù)。 方法： 1.肝螺桿菌的分離、培養(yǎng)、鑒定及致病性評價 從實驗室常用Balb/c小鼠腸粘膜分離培養(yǎng)H.hepaticus，通過Gra

4、m's染色，生化，電鏡下形態(tài)，基因測序鑒定；體外細(xì)胞毒實驗，H.hepaticus超聲裂解物與大腸癌細(xì)胞LoVo共同培養(yǎng)，倒置顯微鏡觀察72h并通過cck-8檢測不同濃度H.hepaticus裂解液對大腸癌細(xì)胞LoVo的細(xì)胞增殖影響，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期變化，Hoechst熒光染色觀察細(xì)胞核形態(tài)特點。 2.腸粘膜炎癥與螺桿菌感染的相關(guān)性調(diào)查 通過腸粘膜細(xì)菌培養(yǎng)和聚合酶鏈反應(yīng)(PolymeraseChainReactio

5、n，PCR)檢測螺桿菌特異性16SrRNA基因初步檢測我國腸道炎癥性疾病和正常人群腸道中螺桿菌感染情況。 結(jié)果： 1.肝螺桿菌的分離、培養(yǎng)、鑒定及致病性評價 Gram's染色，生化，電鏡下形態(tài)，基因測序鑒定成功分離培養(yǎng)出我國首株H.hepaticus，與國外報道不同，該株H.hepaticus硝酸還原試驗陰性；H.hepaticus裂解液與大腸癌細(xì)胞LoVo共同培養(yǎng)，隨著培養(yǎng)時間延長①能引起大腸癌細(xì)胞LoVo形態(tài)

6、改變，貼壁生長的多形細(xì)胞減少，圓形，懸浮細(xì)胞及細(xì)胞碎片增多，②Hoechst染色觀察胞核固縮或脹大，核碎裂，凋亡小體形成，③G2/M期阻滯細(xì)胞比率增加，④隨著裂解液濃度增加對細(xì)胞的殺傷率隨之升高(P=0.000)。 2.腸粘膜炎癥與螺桿菌感染的相關(guān)性調(diào)查 本次實驗并未從腸粘膜中分離培養(yǎng)出螺桿菌，腸粘膜螺桿菌16SrRNA基因檢出率，炎癥性腸病組(inflammatoryboweldisease，IBD)46.2％(6/1

7、3)，非特異性腸炎組檢出率47.2％(17/36)，腫瘤組57.1％(3/7)，對照組9.1％(2/22)，差異有顯著意義(x2=10.629，P=0.014)，20例PCR產(chǎn)物的測序結(jié)果與H.pylori同源性99％。 結(jié)論： 螺桿菌與人類肝腸疾病的相關(guān)性是當(dāng)今研究的新方向，本文從動物中分離出一株硝酸還原陰性的H.hepaticus填補(bǔ)國內(nèi)EHS培養(yǎng)空白，該株H.hepaticus對大腸癌細(xì)胞LoVo具有明顯的體外細(xì)胞