原代培養(yǎng)神經(jīng)元類缺血再灌后UCP4的表達與ROS的關系及前列地爾干預的研究.pdf

1、目的：以原代培養(yǎng)神經(jīng)元為研究對象，建立類缺血再灌注損傷模型，探討原代培養(yǎng)神經(jīng)元類缺血再灌后UCP4的表達與細胞內活性氧水平的變化及前列地爾對其影響。 方法：1、原代神經(jīng)元的培養(yǎng)：取新生24h以內的Wistar大鼠，斷頭消毒，無菌條件下分離皮質并剝離腦膜，將腦組織剪碎后用胰酶消化，后經(jīng)過濾，離心，調整細胞濃度，將細胞用10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基種植于培養(yǎng)板或玻片上。然后置于37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48h后加阿糖胞苷以

2、抑制非神經(jīng)元過度增殖，以后每三天半量換液，并采用神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)鑒定。2、類缺血再灌注模型的建立：將培養(yǎng)10d的細胞全量換為DMEM無糖無血清培養(yǎng)基，放入充有90％氮氣的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30min。然后再換為完全培養(yǎng)基。放入5％CO2的培養(yǎng)箱內。3、實驗分組：將體外培養(yǎng)10d的大鼠皮質神經(jīng)元細胞，隨機分為正常對照組(正常組)、類缺血再灌注組(缺血組)、類缺血再灌注加前列地爾組(實驗組)。正常組正常條件培養(yǎng)，缺血組按上述模型建立

3、，然后轉入正常條件下繼續(xù)培養(yǎng)3h、6h、12h分別取出細胞進行實驗；實驗組在類缺血再灌注模型基礎上于缺血前加入終濃度為45μg/L的前列地爾。4、免疫細胞化學染色檢測UCP4的表達：取出生長有神經(jīng)細胞的蓋玻片，經(jīng)冷凍的無水酒精固定，用UCP4-抗按SP法進行免疫細胞化學染色。5、流式細胞儀檢測細胞內活性氧。6、統(tǒng)計學處理：數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差表示，進行單因素方差分析、SNK法檢驗及兩因素相關分析，P<0.05為有統(tǒng)計學意義。 結

4、果：通過原代神經(jīng)元培養(yǎng)的方法，培養(yǎng)出了可供實驗的原代神經(jīng)元，并在此基礎上成功建立了類缺血再灌注模型。免疫細胞化學染色顯示類缺血再灌3h時UCP4的表達即降低，隨著時間延長，其表達持續(xù)降低，與正常組比較在各時間點上均有差別(P<0.05)，尤以再灌后6h、12h時降低明顯(P<0.01)。對細胞內活性氧，在再灌注3h、6h、12h三個不同時間點ROS亦隨時間在增加，與正常組比較在各時間點上均有差別(P<0.05)。UCP4的表達與ROS量

5、行相關分析顯示二者呈負相關關系(r=-0.745，P<0.05)。實驗組(前列地爾干預組)在再灌后不同時間點UCP4的表達較類缺血再灌組均升高，同時ROS的含量亦降低(P<0.05)。與正常組比較在再灌后不同時間點亦有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。 結論：UCP4在類缺血再灌注后不同時間點的表達呈動態(tài)變化，在再灌注3h時UCP4的表達即降低；再灌注6h時UCP4的表達明顯降低，再灌注12h時其表達仍在下降，提示了UCP4可能參與了