腺病毒介導(dǎo)siMan2c1對(duì)腫瘤的殺傷作用.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)室于2000年報(bào)道克隆到了1個(gè)編碼新的人α-甘露糖苷酶MAN2C1的cDNA。本論文工作的目的是用RNAi技術(shù)抑制Man2c1基因在腫瘤細(xì)胞的表達(dá)，研究對(duì)腫瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響，并探討其治療腫瘤的可能性。首先用本實(shí)驗(yàn)室已有的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pXSN-hU6+27，構(gòu)建了pXSN-hU6+27-siMan2c1。包裝成逆轉(zhuǎn)錄病毒后，感染Man2c1基因高表達(dá)的人食道癌細(xì)胞株EC9706，并作了細(xì)胞克隆。用real-time RT

2、-PCR及用本人制備的抗MAN2C1單抗，檢測(cè)了克隆細(xì)胞的Man2c1基因表達(dá)，見與感染空載體病毒的細(xì)胞相比，克隆細(xì)胞的Man2c1基因表達(dá)明顯抑制。28個(gè)Man2c1因表達(dá)抑制的克隆細(xì)胞株中有15個(gè)在培養(yǎng)中不能存活，剩余的克隆株在培養(yǎng)中生長(zhǎng)緩慢。用流式細(xì)胞儀對(duì)其中2個(gè)克隆株細(xì)胞作凋亡分析，凋亡率分別為7.30％(克隆1)和17.69／0(克隆2)，而野生型細(xì)胞和感染空載體病毒的細(xì)胞(M細(xì)胞)的凋亡率則分別為1.55％和1.44％，表明

3、Man2c1基因表達(dá)抑制促進(jìn)了細(xì)胞凋亡。細(xì)胞周期分析克隆2細(xì)胞的G1期細(xì)胞占28.5％，S期細(xì)胞占43.9％和G2期細(xì)胞占27.6％。而野生型細(xì)胞和感染空載體病毒的細(xì)胞的G1期細(xì)胞比率為59.6％和58.2％，S期細(xì)胞為26.2％和27.09，0，G2期細(xì)胞為14.2％和14.7％。這顯示細(xì)胞的細(xì)胞周期受到了干擾。把細(xì)胞接種裸鼠皮下，腫瘤生長(zhǎng)曲線顯示與野生型細(xì)胞和感染空載體病毒的細(xì)胞相比，Man2c1基因表達(dá)抑制的細(xì)胞的成瘤性生長(zhǎng)受抑。

4、實(shí)驗(yàn)第8周末的腫瘤平均重量為1.52±0.53g(克隆1)、1.47±0.62 g(克隆2)、3.033±0.65g(W細(xì)胞)和2.74±1.06g(M細(xì)胞)。克隆1或克隆2與W細(xì)胞或M細(xì)胞間的差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t檢驗(yàn)，p<0.05)。這些數(shù)據(jù)表明，所設(shè)計(jì)的siMan2c1能有效抑制Man2c1基因的表達(dá)，Man2c1基因表達(dá)抑制對(duì)食管癌細(xì)胞EC9706的惡性生物學(xué)行為有明顯的抑制作用。蛋白質(zhì)的N-糖基化與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，Con

5、 A與Man2c1基因表達(dá)抑制的EC9706細(xì)胞的結(jié)合明顯低于對(duì)照細(xì)胞的現(xiàn)象提示，細(xì)胞蛋白質(zhì)N-糖基化的變化可能在EC9706細(xì)胞惡性生物學(xué)行為減弱中起作用。 本論文工作隨即用腺病毒載體pDC316-EGFP-U6構(gòu)建了重組腺病毒質(zhì)粒，并包裝成腺病毒Ad5-siMan2c1。由于檢測(cè)不到Ad5-siMan2c1感染對(duì)EC9706細(xì)胞在培養(yǎng)中生長(zhǎng)的影響(可能與Ad5-siMan2c1對(duì)EC9706細(xì)胞的感染率低有關(guān))，我改用人鼻咽

6、癌細(xì)胞CNE-2L2做靶細(xì)胞，因?yàn)锳d5-siMan2c1對(duì)CNE-2L2細(xì)胞的感染率高，且Ad5-siMan2c1感染對(duì)CNE-2L2細(xì)胞在培養(yǎng)中的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用。把Ad5-siMan2c1射入接種野生型CNE-2L2細(xì)胞于裸鼠皮下所長(zhǎng)的腫瘤，見與注射PBS或Ad5-EGFP相比，腫瘤的生長(zhǎng)受抑(P<0.05)。由于在本實(shí)驗(yàn)室以往對(duì)Man2c1基因表達(dá)抑制的CNE-2L2細(xì)胞與野生型CNE-2L2細(xì)胞所作的mRNA差異表達(dá)分析中

7、，見前者高表達(dá)的基因中以BCSC-1表達(dá)增強(qiáng)最顯著，在前者低表達(dá)的基因中以CD44表達(dá)減弱最顯著，而且本實(shí)驗(yàn)室新近的研究確認(rèn)BCSC-1基因異位表達(dá)或用siRNA抑制CD44表達(dá)，均使CNE-2L2細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為減弱，故我也研究了腺病毒載體介導(dǎo)的對(duì)CNE-2L2細(xì)胞所長(zhǎng)腫瘤的BCSC-1基因治療和siCD44治療。結(jié)果表明BCSC-1與siCD44均有治療作用。以上結(jié)果證明，Man2c1有可能成為某些腫瘤治療的靶基因，BCSC-1