脂聯(lián)素對內(nèi)皮細胞組織因子和組織因子途徑抑制物表達的影響及機制研究.pdf

1、研究背景: 脂聯(lián)素(Adp)作為一種脂肪源性的細胞因子，具有改善胰島素敏感性、保護內(nèi)皮細胞功能、抗炎、抗動脈粥樣硬化的作用。流行病學研究顯示脂聯(lián)素水平與胰島素抵抗及血栓性疾病發(fā)病呈負相關。脂聯(lián)素可以抑制單核細胞黏附分子及炎癥因子的表達、抑制巨噬細胞轉(zhuǎn)化為泡沫細胞、抑制血管平滑肌細胞增殖及遷移，還可以增加內(nèi)皮細胞一氧化氮產(chǎn)生及減少氧自由基的產(chǎn)生。脂聯(lián)素可通過胰島素增敏、抗炎、抗動脈粥樣硬化、抗增殖和抗氧化等多重機制來保護內(nèi)皮細胞功

2、能。 由于血栓性疾病與凝血系統(tǒng)活性密切相關，而內(nèi)皮細胞功能障礙可以引起凝血活性異常。但是對于脂聯(lián)素對凝血系統(tǒng)活性有無影響，目前仍不清楚。組織因子(TF)是凝血系統(tǒng)啟動的關鍵因子，TF介導的凝血激活在動脈粥樣硬化、冠心病等血栓形成性疾病的發(fā)病中起了非常重要的作用。組織因子途徑抑制物(TFPI)是TF直接的生理性抑制物，在調(diào)節(jié)血栓形成過程中有重要作用。然而，脂聯(lián)素對內(nèi)皮細胞的保護作用是否會影響在血栓形成過程中有重要作用的凝血因子TF

3、及TFPI的表達，國內(nèi)外尚無文獻報道。因此研究脂聯(lián)素對凝血活性的影響有著重要的意義，可以進一步闡明血栓形成的部分機制，并能為防治血栓形成提供重要的理論依據(jù)。正是基于上述原因，本研究對脂聯(lián)素對內(nèi)皮細胞TF及TFPI表達的影響及機制進行探討。 本研究由以下三部分組成： 第一章 TNF-α對內(nèi)皮細胞組織因子和組織因子途徑抑制物表達的影響 目的：觀察在腫瘤壞死因子-α(TNF-α)刺激下對人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)

4、表達TF及TFPI的影響。 方法：HUVECs培養(yǎng)采用RPMI 1640完全培養(yǎng)基；臺盼藍染色法觀察細胞活力；酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)法測定TF抗原和TFPI抗原的表達；逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測TF及TFPI基因的表達。 結果：各濃度的TNF-α對HUVECs的細胞活力無明顯影響；TNF-α促進TF抗原的表達，并呈劑量和時間依賴關系，在TNF-α10 ng/ml作用6h時最明顯；TNF-α促進TF

5、mRNA的表達，并呈劑量和時間依賴關系，在TNF-α10ng/ml作用3h時已非常明顯，6h時達到高峰；TNF-α對HUVECs表達TFPI抗原及TFPI mRNA無明顯影響。 結論：TNF-α可以誘導HUVECs細胞表達TF；TNF-α對HUVNEC細胞TFPI的表達無明顯影響。 第二章脂聯(lián)素對TNF-α誘導內(nèi)皮細胞組織因子和組織因子途徑抑制物表達的影響 目的：觀察脂聯(lián)素對TNF-α誘導HUVECs細胞表達TF

6、和TFPI的影響。 方法：HUVECs培養(yǎng)采用RPMI1640完全培養(yǎng)基；臺盼藍染色法觀察細胞活力；ELISA法測定TF抗原和TFPI抗原的表達；發(fā)色底物法測定TF及TFPI活性； RT-PCR檢測TF mRNA及TFPImRNA的表達。 結果：各濃度的脂聯(lián)素對HUVECs的細胞活力無明顯影響；脂聯(lián)素可以在轉(zhuǎn)錄水平、蛋白水平上抑制由TNF-α誘導的人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞TF的表達，同時TF活性水平也明顯減低；單純脂聯(lián)素對內(nèi)

7、皮細胞表達TF表達無影響；脂聯(lián)素可以上調(diào)TFPI的抗原水平及活性水平，但脂聯(lián)素不影響TFPI mRNA的表達水平。 結論：脂聯(lián)素可以在轉(zhuǎn)錄及蛋白水平上明顯抑制TNF-α誘導HUVECs細胞TF的表達；脂聯(lián)素上調(diào)TFPI抗原表達可能是在轉(zhuǎn)錄后水平進行的。 第三章脂聯(lián)素調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞組織因子和組織因子途徑抑制物表達的機制研究 目的：前文已經(jīng)報道脂聯(lián)素能抑制TNF-α誘導的HUVECs表達TF，并能在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)TFP

8、I的表達。本實驗詳細探討脂聯(lián)素抑制TNF-α誘導的HUVECs表達TF及上調(diào)TFPI表達的信號傳導通路。 方法：HUVECs培養(yǎng)采用RPMI 1640完全培養(yǎng)基；臺盼藍染色法觀察細胞活力；ELISA法測定TF抗原和TFPI抗原的表達；發(fā)色底物法測定TF及TFPI活性；ELISA法檢測NF-κB結合活性；酶免疫分析(EIA)法檢測cAMP含量；PepTag法分析PKA活性水平；蛋白印跡法檢測p38MAPK、p44/42MAPK、S

9、APK/JNK、Akt、IκB-α的蛋白磷酸化水平。 結果：脂聯(lián)素使IκB-α磷酸化水平減少，但對p38MAPK、p44/42MAPK及SAPK/JNK的磷酸化水平無影響；脂聯(lián)素呈劑量依賴性的增加cAMP含量和PKA活性水平；脂聯(lián)素抑制TNF-α誘導的TF表達可以被PKA的特異性抑制劑Rp-cAMPs逆轉(zhuǎn)，并不影響脂聯(lián)素上調(diào)TFPI抗原的水平；脂聯(lián)素使Akt的磷酸化水平增加；脂聯(lián)素可明顯抑制TNF-a誘導的IkB-a的磷酸化水平

10、及NF-kB結合活性水平；PI3K的特異性抑制劑LY294002也能部分逆轉(zhuǎn)脂聯(lián)素對TF表達的抑制作用，預先聯(lián)合Rp-cAMPs和LY294002處理細胞能使脂聯(lián)素的抑制作用被逆轉(zhuǎn)約95％，脂聯(lián)素對TFPI抗原的上調(diào)作用不被這兩種抑制劑影響。 結論：PI3K-Akt和cAMP-PKA信號途徑的活化介導了脂聯(lián)素抑制TNF-a誘導內(nèi)皮細胞表達TF的作用；NF-kB信號途徑活性受抑在脂聯(lián)素抑制TNF-a誘導的內(nèi)皮細胞表達TF起了非常重