外源性T-bet基因轉(zhuǎn)入對小鼠肺癌細(xì)胞株Lewis生物學(xué)作用的影響.pdf

1、目的:
　　 以Lewis細(xì)胞株為靶向,體外觀察轉(zhuǎn)入外源T-bet基因?qū)δ[瘤細(xì)胞生物學(xué)特性和IFN-γ表達(dá)的影響,研究轉(zhuǎn)錄因子T-bet在抗腫瘤免疫中的作用；體內(nèi)分析T-bet質(zhì)粒(pIRES2-mT-bet—EGFP)對Lewis細(xì)胞小鼠皮下移植瘤發(fā)生發(fā)展的影響,探討應(yīng)用T-bet改變腫瘤微環(huán)境、改善腫瘤機(jī)體免疫平衡狀態(tài)的可能性。
　　 方法:
　　 (1)構(gòu)建plRES2-mT-bet-EGFP載體,應(yīng)用脂質(zhì)

2、體轉(zhuǎn)染的方法[質(zhì)粒(μg):脂質(zhì)體(1μl)=1:2]轉(zhuǎn)染Lewis細(xì)胞,PCR檢測轉(zhuǎn)染前后T-bet,IFN-γ的mRNA表達(dá)水平；流式細(xì)胞術(shù)檢測EGFP；ELISA檢測分泌的IFN-γ。以PIRES-eGFP質(zhì)粒作為對照。
　　 (2)將1.5×106 Lewis肺癌細(xì)胞接種于小鼠右肩部皮下,制備皮下轉(zhuǎn)移瘤小鼠模型；分三組分別瘤內(nèi)注射PIRES—eGFP／mT-bet、PIRES-eGFP質(zhì)粒和PBS。
　　 (3)

3、觀察各組小鼠存活時間,腫瘤體積的變化；HE染色觀察腫瘤組織的病理改變；Western-Blot檢測腫瘤組織T—bet的表達(dá),QRT-PCR檢測腫瘤組織T-bet和IFN-γ的mRNA水平。
　　 (4)觀察局部引流淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移情況,QRT-PCR檢測引流淋巴結(jié)T-bet和IFN-γ的mRNA的水平。
　　 (5)QRT-PCR檢測脾臟T-bet和IFN-γ的mRNA。
　　 結(jié)果:
　　 (1)用脂質(zhì)體成

4、功將T-bet基因轉(zhuǎn)染Lewis細(xì)胞,通過對轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞的研究表明,與對照組相比,T-bet和IFN-γ mRNA及蛋白的表達(dá)水平均明顯升高。
　　 (2)建立了肺癌的皮下轉(zhuǎn)移瘤小鼠模型,小鼠皮下移植瘤的發(fā)病率為100％,發(fā)病時間在Lewis細(xì)胞注射后6～7天；
　　 (3)瘤內(nèi)注射pIRES2-mT-bet-EGFP后發(fā)現(xiàn),pIRES2-mT-bet-EGFP干預(yù)組小鼠腫瘤生長明顯變緩,存活期延長。Western-bl

5、ot檢測結(jié)果顯示,腫瘤組織T-bet蛋白表達(dá)顯著高于對照組；QRT-PCR結(jié)果顯示,腫瘤組織T-bet和IFN-γ的mRNA水平呈上升趨勢,與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。HE染色組織病理觀察可見mT-bet干預(yù)組小鼠局部組織淋巴細(xì)胞大量浸潤。
　　 (4)腫瘤局部注射pIRES2-mT-bet-EGFP明顯延緩腫瘤局部引流淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移,QRT-PCR結(jié)果顯示,與對照組相比較,T-bet質(zhì)粒干預(yù)組發(fā)生轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)T

6、-bet和IFN-γ的mRNA水平呈上升趨勢(P<0.05),而脾臟T-bet和IFN-γ的mRNA水平表達(dá)沒有影響(P>0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 T-bet基因轉(zhuǎn)染肺癌細(xì)胞株(Lewis細(xì)胞)可以明顯改善IFN-γ的表達(dá)。T-bet質(zhì)粒局部注射可延緩小鼠肺癌Lewis皮下移植瘤的生長,延長小鼠的存活期,增強(qiáng)對已發(fā)腫瘤的生長限制作用,并且可以延緩腫瘤局部引流淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移,為基因介入的腫瘤生物治療奠定了基礎(chǔ),為T-