杭白菊提取物效應成分的吸收、代謝和藥物相互作用研究.pdf

1、菊花為菊科植物菊〔ChrysanthemummorifoliumRamat.)的干燥頭狀花序。具有疏風散熱、明目、平肝和清熱解毒之功效。現(xiàn)代藥理學研究表明，菊花具有抗氧化和治療心血管疾病等多種藥理作用。進一步的研究表明，菊花的功效與其所含黃酮類化合物密切相關。而木犀草素(Luteolin)-7-O-β-D-葡萄糖苷和芹菜素(Apigenin)-7-O-β-D-葡萄糖苷為菊花中主要的黃酮類化合物，可在體內(nèi)水解生成效應成分木犀草素和芹菜素。

2、 本課題組已對菊花提取物(CME)中主要黃酮類成分的藥代動力學、排泄和組織分布等體內(nèi)過程進行了一系列的研究，表明口服菊花提取物后，體內(nèi)主要的效應成分為木犀草素和芹菜素，大鼠藥動學結(jié)果顯示，芹菜素的AUC顯著高于木犀草素；木犀草素和芹菜素可經(jīng)尿液、糞便和膽汁排泄；大鼠灌喂菊花提取物后，木犀草素和芹菜素廣泛分布于各組織，二者在健康大鼠及心肌缺血大鼠中的分布存在一定差異(芹菜素在心肌缺血大鼠心肌中的分布顯著高于健康大鼠)。但是，菊花中

3、主要黃酮苷類化合物在大鼠體內(nèi)的水解和吸收部位、水解部位環(huán)境的改變對其水解是否存在影響以及造成芹菜素AUC顯著高于木犀草素的機制目前尚未闡明。此外，由于菊花藥食同源，與許多藥物存在伍用的可能，那么它是否會在吸收和代謝水平與伍用藥物發(fā)生相互作用，也未見報道。為了闡明上述問題，本文采用多種模型，分別在體內(nèi)、在體和體外水平，研究CME活性成分的吸收、代謝以及藥物相互作用，以期為該類藥物的體內(nèi)過程研究提供新的思路和方法，并為臨床合理用藥和科學評價

4、CME的藥效學、藥動學和毒理學提供依據(jù)， 1.CME活性成分在大鼠體內(nèi)的水解和吸收 目的： 評價CME活性成分在大鼠消化道內(nèi)的脫糖代謝和吸收情況。 方法： 建立大鼠消化道內(nèi)容物和組織中木犀草素和芹菜素的HPLC分析方法，研究CME效應成分——木犀草素和芹菜素在大鼠消化道的分布規(guī)律。 結(jié)果： 1)給藥5min后，即可在血以及胃、十二指腸和空腸的內(nèi)容物和組織中檢測到木犀草素和芹菜素，表

5、明CME在大鼠消化道內(nèi)的水解和分布相當迅速。 2)二者在胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸和結(jié)腸內(nèi)容物中最高濃度分別出現(xiàn)在5min、5min、2h、5h和8h，消化道總滯留時間超過12h，特別是在大腸內(nèi)可長時間保持較高濃度。 3)木犀草素和芹菜素迅速出現(xiàn)在血液中，但消除相對緩慢，木犀草素和芹菜素的Tmax分別為30min和5h，表明木犀草素的吸收主要在消化道前段，而芹菜素的吸收部位可能更為廣泛，芹菜素在12h時仍維持較高血藥

6、濃度。 4)木犀草素和芹菜素在血、組織和內(nèi)容物中的相對比例呈現(xiàn)一定特征，血中芹菜素的濃度遠遠高于木犀草素，在胃和小腸內(nèi)容物中二者比例相當，但在盲腸和結(jié)腸內(nèi)容物中木犀草素含量顯著高于芹菜素。 結(jié)論： CME在大鼠消化道內(nèi)可發(fā)生迅速和廣泛的水解代謝，生成效應成分木犀草素和芹菜素，這一過程存在明顯的消化道和底物選擇性。 2.應用大鼠消化道原位結(jié)扎灌注技術研究CME活性成分的水解和吸收 目的： 分

7、段評價各消化道的水解和吸收能力，以及影響水解和吸收的因素。 方法： 采用原位結(jié)扎灌注模型分別將CME與不同消化道進行孵化，同時采集血液、組織和內(nèi)容物樣品，評價不同吸收部位的水解和吸收差異，然后選擇空腸測定了其水解和吸收動力學，并對影響其水解和吸收的因素(內(nèi)容物、腸道菌、長期用藥、性別和胃內(nèi)酸性環(huán)境)進行了評價。 結(jié)果： 1)不同消化道組織均可水解CME活性成分，原位孵化10min后，各消化道內(nèi)容物和組織中

8、均可檢測到木犀草素和芹菜素，盲腸對木犀草素苷的水解能力顯著高于對芹菜素苷的水解能力，其他消化道對二者的水解能力相當，水解率均大于50％。木犀草素和芹菜素可被各消化道組織攝取，但僅在小腸段可以透過消化道進入血液。 2)空腸原位孵化實驗表明，CME活性成分的水解和吸收均很迅速，在內(nèi)容物和組織中的最高濃度均為第一個時間點5min。其中芹菜素的吸收強于木犀草素，二者最高血藥濃度分別為8.43和5.41μg/mL，AUCO-∞分別為999

9、±100和339.4±49.9mg/L*min，且水解和吸收過程呈現(xiàn)線性動力學特征。 3)除去內(nèi)容物、應用抗生素以及長期用藥均使空腸內(nèi)容物中木犀草素和芹菜素的含量出現(xiàn)一定程度降低，同時去除內(nèi)容物使得組織攝取和吸收入血的量大大提高，但不同性別間未發(fā)現(xiàn)明顯差異，其他因素對組織攝取和血藥濃度影響也不大。 結(jié)論： CME活性成分在各消化道均可發(fā)生迅速和廣泛的水解代謝，但只有小腸段可有效的吸收木犀草素和芹菜素，這一水解和吸

10、收過程具有消化道和底物選擇性，并受多種因素影響。 3.CME活性成分在大鼠組織提取物中的脫糖代謝 目的： 體外評價各消化道以及肝、肺和腎組織提取物對CME活性成分的水解代謝。 方法： CME與各組織提取物共孵育，測定生成的木犀草素和芹菜素，通過考察底物濃度、孵育時間和酶濃度，確定最佳孵育條件，并在該條件下評價了不同組織提取物的水解代謝能力。采用LC-MS對其代謝產(chǎn)物進行了鑒定。 結(jié)果：

11、 最佳孵育條件為：底物濃度18.75mg/mL，酶濃度0.50mg蛋白/mL，孵育時間30min。CME活性成分在各組織提取物中均可發(fā)生水解代謝，生成效應成分木犀草素和芹菜素。其中腎組織提取物的水解代謝能力最強，消化道組織中，空腸組織提取物的水解能力最強，胃水解能力最差，其他腸段組織提取物的水解能力介于空腸和胃之間。 結(jié)論：CME活性成分可發(fā)生廣泛的水解代謝，生成效應成分木犀草素和芹菜素，腎和空腸組織提取物的水解能力最強。

12、 4.木犀草素和芹菜素在大鼠原代肝細胞中的代謝 目的： 考察CME中效應成分木犀草素和芹菜素在肝臟發(fā)生的結(jié)合代謝反應。 方法： 采用原代肝細胞模型考察了二者的消除過程以及黃酮類化合物對其消除過程的影響。 結(jié)果： 1)木犀草素和芹菜素在原代肝細胞中的消除非常迅速，孵育120min，木犀草素和芹菜素的消除比率分別達到91.9％和86.7％，經(jīng)二相結(jié)合物水解酶水解測得二者的二相代謝產(chǎn)物分別

13、占給藥量的54％和73％。 2)性別和pH對其消除影響不大。 3)少量木犀草素可轉(zhuǎn)化為芹菜素(<5％)。 4)二者在消除過程中存在飽和現(xiàn)象，隨著濃度增加，消除率下降；二者間同樣存在相互抑制作用，木犀草素抑制芹菜素的IC50為17.3μmol/L，而芹菜素抑制木犀草素的IC50為38.2μmol/L，且二者在HCME中消除時所受到的抑制與二者間的相互抑制作用相近，說明二者在提取物中消除所受到的抑制主要來自它們自身的

14、相互作用，與其他成分關系較小。 5)多種黃酮苷對二者消除均無明顯影響，黃酮苷元中黃酮醇和黃酮類成分對其抑制作用明顯，異黃酮苷元和兒茶素類對其消除無明顯影響。 結(jié)論： CME效應成分木犀草素、芹菜素在大鼠原代肝細胞中可迅速發(fā)生二相代謝，這一過程可能發(fā)生藥物-藥物相互作用。 5.CME活性成分對大鼠原代肝細胞藥物代謝酶的調(diào)節(jié) 目的： 考察CME及其效應成分木犀草素、芹菜素對肝一相藥物代謝酶的調(diào)

15、節(jié)作用。 方法： 采用大鼠原代肝細胞模型，考察上述成分對各CYP3A探針底物睪酮和硝苯地平以及CYP2E探針底物氯唑沙宗消除的影響。 結(jié)果： 孵育1h后，睪酮的代謝分別被木犀草素、芹菜素、CME和HCME抑制了44.0±8.2％、48.5±4.7％、20.1±0.4％和70.5±0.8％；孵育2h后，硝苯地平的代謝分別被四者抑制了79.1±1.3％、80.1±0.2％、60.4±2.6％和92.2±0.4

16、％；孵育2h后，氯唑沙宗的代謝分別被抑制了54.3±0.2％、42.6±0.8％、41.9±2.7％和69.9±1.8％。抑制能力為HCME物>木犀草素≈芹菜素>CME。 結(jié)論： 木犀草素、芹菜素、CME和HCME對原代肝細胞CYP3A和CYP2E均有一定抑制作用，水解代謝可激活抑制代謝酶的能力。 6.CME活性成分對過表達人MDR1細胞中P-gp的調(diào)節(jié) 目的： 考察CME及其效應成分木犀草素、芹

17、菜素對人P-gp的調(diào)節(jié)作用方法：分別采用Bcap-MDR1和MDCK-MDR1模型，考察木犀草素、芹菜素、CME和HCME對R123在細胞內(nèi)積聚的影響。 結(jié)果： 木犀草素、芹菜素、CME和HCME對人P-gp有明顯抑制作用，這一抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴性，Bcap-MDR1中，四者的最高劑量可分別使羅丹明的攝取達對照組的2.79±0.063、1.68±0.078、1.15±0.051和5.73±0.073倍；MDCK-MDR