維生素D受體在人腹膜間皮細胞轉(zhuǎn)分化中的作用及分子機制研究.pdf

1、腹膜透析(PD)是終末期腎臟病(ESRD)重要替代療法之一。長期腹膜透析患者可以導(dǎo)致腹膜纖維化，進而引起腹膜失超濾是腹膜透析患者退出腹膜透析治療的重要原因之一。長期腹透患者腹膜長期暴露在高糖透析液中，生物不相容的腹透液能導(dǎo)致腹膜間皮細胞失去正常的形態(tài)和功能，最終導(dǎo)致腹膜纖維化和腹膜失超濾。高糖(HG)所致的腹膜上皮細胞向間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)分化(EMT)能導(dǎo)致腹膜纖維化和超濾喪失。它可導(dǎo)致腹膜間皮細胞失去間皮細胞的特點，如細胞極性和粘附，E-c

2、adherin等表達減少，向成纖維細胞轉(zhuǎn)化，如遷移和侵襲，同時α-SMA、FN表達升高。因此，延緩EMT的進展對緩解腹膜纖維化及保護腹膜間皮細胞具有重要的意義。
　　近年來研究表明，維生素D除了調(diào)節(jié)鈣、磷的代謝，其新的生物學(xué)功能逐漸被人們發(fā)現(xiàn)，如調(diào)節(jié)細胞增殖和分化及調(diào)節(jié)免疫功能等。VDR在導(dǎo)致的人腹膜間皮細胞(HPMCs)EMT中的作用及相關(guān)機制尚不清楚。
　　本項目在既往工作基礎(chǔ)上，利用體外人腹膜間皮細胞EMT模型，檢測V

3、DR的表達及EMT相關(guān)標(biāo)志物E-cadherin、α-SMA、FN等信號分子的基因、蛋白表達以及應(yīng)用VDR的配體1，25(OH)2D3上調(diào)VDR表達后EMT的變化;采用shRNA干擾，研究VDR表達下調(diào)后EMT變化以及TGFβ/Smad信號通路在腹膜EMT中的調(diào)控作用。進一步觀察VDR調(diào)控該信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的作用靶點，探討其抗腹膜纖維化的細胞分子機制，以期探尋腹膜失超濾的新機制和防治的新策略。
　　論文一 VDR在人腹膜間皮細胞EM

4、T模型中的表達及其與EMT的關(guān)系
　　目的：
　　利用人腹膜間皮細胞EMT模型，初步探討EMT過程中VDR的表達及與EMT的關(guān)系
　　方法：
　?。ㄒ唬嶒灱毎?br>　　人腹膜間皮細胞株(HMrSV)由法國巴黎TENON醫(yī)院Pierre RONCO教授建立;由中國醫(yī)科大學(xué)附屬一院徐惠綿教授及那迪醫(yī)師饋贈。
　　（二）實驗方法
　　應(yīng)用高糖刺激人腹膜間皮細胞株，建立人腹膜間皮細胞EMT模型，運用Rea

5、ltime PCR、Western Blot方法檢測高糖刺激人腹膜間皮細胞不同濃度及不同時間后上皮細胞標(biāo)志物E-cadherin及間充質(zhì)細胞標(biāo)志物α-SMA和FN信號分子的基因、蛋白表達水平及VDR表達水平變化。
　?。ㄈ嶒灧纸M
　　1、對照組:只加入10％胎牛血清的1640培養(yǎng)基（葡萄糖濃度0.2％）作用24h。
　　2、高糖作用不同濃度組:加入10％胎牛血清的1640培養(yǎng)基并且含不同濃度1.5％，2.5％，4.

6、25％的葡萄糖作用24h。
　　3、高糖作用不同時間組:2.5％葡萄糖分別作用0，6，12h，24h，48h。
　　結(jié)果：
　　1、不同濃度葡萄糖對HPMCs的VDR表達的影響
　　Real time PCR及Western Blot結(jié)果顯示，1.5％濃度的葡萄糖作用于HPMCs可使 HPMCs的VDR從mRNA和蛋白水平表達均減少。并且隨著葡萄糖濃度增加，VDRmRNA和蛋白表達逐漸減少，4.25％葡萄糖作用達

7、到最強。
　　2、葡萄糖作用不同時間對HPMCs的VDR表達的影響
　　Real time PCR及Western Blot結(jié)果顯示，2.5％葡萄糖作用6小時HPMCs的VDRmRNA和蛋白表達減少。并且隨著葡萄糖作用時間延長，VDRmRNA和蛋白表達逐漸減少，2.5％葡萄糖作用HPMCs48小時VDRmRNA和蛋白表達最少。
　　3、不同濃度葡萄糖對HPMCs的EMT的影響
　　Western Blot結(jié)果顯示

8、，1.5％葡萄糖可使HPMCs的間充質(zhì)細胞標(biāo)志物α-SMA、FN蛋白表達增加，上皮細胞標(biāo)志物E-cadherin表達減少，提示腹膜間皮細胞發(fā)生EMT改變。且隨著葡萄糖濃度增加，EMT改變逐漸明顯，4.25％葡萄糖作用最強。
　　4、葡萄糖作用不同時間對HPMCs的EMT的影響
　　Western Blot結(jié)果顯示，2.5％葡萄糖作用6小時HPMCs的間充質(zhì)細胞標(biāo)志物α-SMA、FN蛋白表達增加，上皮細胞標(biāo)志物E-cadher

9、in表達減少，提示腹膜間皮細胞發(fā)生EMT改變。并且隨著葡萄糖作用時間延長，EMT改變逐漸明顯，2.5％葡萄糖作用HPMCs48小時EMT改變最明顯。
　　結(jié)論：
　　1、人腹膜間皮細胞存在VDR的表達。
　　2、高糖從基因及蛋白的水平以濃度依賴及時間依賴的方式下調(diào)體外培養(yǎng)的人腹膜間皮細胞VDR的表達。
　　3、高糖從以濃度依賴及時間依賴的方式誘導(dǎo)EMT，EMT與VDR表達負相關(guān)。
　　論文二 上調(diào)及下調(diào)VD

10、R表達后對HPMCs細胞EMT的影響
　　目的：
　　觀察應(yīng)用1，25(OH)2D3上調(diào)VDR表達后對EMT的影響。構(gòu)建VDRshRNA質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染腹膜間皮細胞。觀察應(yīng)用VDRshRNA下調(diào)VDR表達后對EMT的影響。探討VDR在HPMCs細胞EMT過程中的作用及機制。
　　方法：
　　常規(guī)培養(yǎng)HPMCs，應(yīng)用2.5％葡萄糖刺激HPMCs細胞24h制造HPMCs EMT模型，在此過程中分別用1，25(OH)2D3刺

11、激HPMCs上調(diào)VDR表達，應(yīng)用VDRshRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HPMCs下調(diào)VDR表達，運用Real time PCR、Western Blot、免疫熒光等方法檢測VDR表達水平及分別上調(diào)和下調(diào)VDR表達后EMT相關(guān)標(biāo)志物E-cadherin、α-SMA、FN等信號分子的變化水平。
　　結(jié)果：
　　1、1，25(OH)2D3對高糖刺激下人腹膜間皮細胞EMT的影響
　　Western Blot結(jié)果顯示，2.5％高糖刺激HPMC

12、s24小時能顯著上調(diào)間充質(zhì)細胞標(biāo)志物αSMA，F(xiàn)N表達水平，下調(diào)上皮細胞標(biāo)志物E-cadherin表達，提示腹膜間皮細胞發(fā)生了EMT改變。應(yīng)用10-7 mol/L1，25(OH)2D3上調(diào)VDR表達后，顯著下調(diào)αSMA，F(xiàn)N表達水平，上調(diào)E-cadherin表達水平，提示1，25(OH)2D3能夠部分逆轉(zhuǎn)腹膜間皮細胞EMT的發(fā)生。免疫熒光結(jié)果亦表明，高糖能顯著上調(diào)αSMA表達，應(yīng)用1，25(OH)2D3后能夠部分逆轉(zhuǎn)高糖所致的αSMA表

13、達上調(diào)。
　　2、VDRshRNA對高糖刺激下人腹膜間皮細胞EMT的影響
　　Western Blot結(jié)果顯示，高糖能顯著上調(diào)αSMA，F(xiàn)N表達水平，下調(diào)E-cadherin表達，提示腹膜間皮細胞發(fā)生了EMT改變。應(yīng)用VDRshRNA轉(zhuǎn)染腹膜間皮細胞下調(diào)VDR表達后，EMT標(biāo)志物αSMA，F(xiàn)N表達進一步上調(diào)，E-cadherin表達進一步下調(diào)，提示應(yīng)用VDRshRNA下調(diào)VDR表達能夠加劇腹膜間皮細胞EMT改變。
　　

14、結(jié)論：
　　1、高糖能夠誘導(dǎo)人腹膜間皮細胞發(fā)生EMT改變。應(yīng)用1，25(OH)2D3上調(diào)VDR表達能夠部分逆轉(zhuǎn)腹膜間皮細胞EMT的發(fā)生。
　　2、應(yīng)用VDRshRNA下調(diào)VDR表達后能夠加劇腹膜間皮細胞EMT改變。
　　論文三 TGFβ/Smad通路對HPMCs細胞EMT的影響
　　目的：
　　觀察應(yīng)用1，25(OH)2D3上調(diào)VDR表達后TGFβ/Smad通路的變化。構(gòu)建VDRshRNA質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染腹膜間皮

15、細胞。觀察應(yīng)用VDRshRNA下調(diào)VDR表達后TGFβ/Smad通路的變化。探討TGFβ/Smad通路在HPMCs細胞EMT過程中的作用及機制。
　　方法：
　　常規(guī)培養(yǎng)HPMCs，用2.5％葡萄糖刺激HPMCs細胞24h制造HPMCs EMT模型，在此過程中分別用1，25(OH)2D3上調(diào)VDR表達，應(yīng)用VDRshRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HPMCs下調(diào)VDR表達，運用Real time PCR、Western Blot等方法檢測TG

16、Fβ，Smad3，p-Smad3等信號分子的變化水平。
　　結(jié)果：
　　1、1，25(OH)2D3對高糖刺激下人腹膜間皮細胞TGFβ/Smad通路的影響Real time PCR結(jié)果顯示，高糖能顯著上調(diào)TGFβmRNA表達水平，應(yīng)用1，25(OH)2D3預(yù)孵育后能夠部分下調(diào)腹膜間皮細胞TGFβmRNA表達水平。WesternBlot結(jié)果顯示，高糖能顯著上調(diào)TGFβ及磷酸化Smad3蛋白表達水平。應(yīng)用1，25(OH)2D3預(yù)孵

17、育后能夠部分下調(diào)腹膜間皮細胞TGFβ及磷酸化Smad3蛋白表達。
　　2、VDR表達對高糖刺激下人腹膜間皮細胞TGFβ/Smad通路的影響
　　Real time PCR結(jié)果顯示，高糖能顯著上調(diào)TGFβmRNA表達水平，應(yīng)用1，25(OH)2D3上調(diào)VDR表達能夠部分逆轉(zhuǎn)腹膜間皮細胞TGFβmRNA表達水平，應(yīng)用VDRshRNA下調(diào)VDR表達后能夠進一步上調(diào)腹膜間皮細胞TGFβmRNA表達水平。Western Blot結(jié)果顯

18、示，高糖能顯著上調(diào)TGFβ及磷酸化Smad3蛋白表達水平。應(yīng)用1，25(OH)2D3上調(diào)VDR表達能夠下調(diào)腹膜間皮細胞TGFβ及磷酸化Smad3蛋白表達，應(yīng)用VDRshRNA下調(diào)VDR表達后能夠進一步上調(diào)腹膜間皮細胞TGFβ及磷酸化Smad3蛋白表達。
　　結(jié)論：
　　1、高糖能夠激活TGFβ/Smad信號通路，應(yīng)用1，25(OH)2D3上調(diào)VDR表達后能夠通過下調(diào)TGFβ/Smad信號通路從而緩解人腹膜間皮細胞EMT。