雙調(diào)控溶瘤腺病毒攜帶超抗原SEA基因治療前列腺癌基礎(chǔ)研究.pdf

1、目的：構(gòu)建表達(dá)超抗原SEA基因的由前列腺特異性抗原（PSA）啟動(dòng)子及端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT）啟動(dòng)子雙調(diào)控的特異性增殖溶瘤腺病毒SG504-SEA。體外實(shí)驗(yàn)觀察SEA基因的表達(dá)及其刺激淋巴細(xì)胞對(duì)腫瘤的殺傷功能，及SEA 促細(xì)胞因子分泌作用。
　　 方法：從前列腺癌組織基因組DNA中獲得522bp大小的PSA 啟動(dòng)子序列，將PSA啟動(dòng)子克隆到由hTERT 啟動(dòng)子調(diào)控的特異性增殖溶瘤腺病毒載體SG502中，得到靶向前列腺癌細(xì)胞的雙

2、調(diào)控溶瘤腺病毒載體SG504。將已構(gòu)建好的含有771bp大小SEA基因片段的病毒骨架質(zhì)粒PPE3-ccdb-SEA 與SG504 用Lipofectamine2000 共轉(zhuǎn)染至293細(xì)胞。共轉(zhuǎn)染后9～14d 出現(xiàn)病毒空斑，經(jīng)過(guò)三次病毒空斑純化，經(jīng)鑒定正確的腺病毒命名為SG504-SEA,即攜帶SEA基因的雙調(diào)控靶向前列腺癌的特異性溶瘤腺病毒。通過(guò)RT-PCR 檢測(cè)SEA 在前列腺癌DU145 細(xì)胞內(nèi)不同時(shí)間段mRNA表達(dá)，分別于12、2

3、4、48h 提取細(xì)胞總RNA 行RT-PCR 檢測(cè)SEA 在核酸水平的表達(dá)量；將重組病毒以5MOI的滴度感染腫瘤細(xì)胞DU145，分別于12、24、48h 取出，免疫熒光定位SEA表達(dá)于前列腺癌細(xì)胞；western blot測(cè)定SEA蛋白表達(dá)；顯微鏡下動(dòng)態(tài)觀測(cè)淋巴細(xì)胞與前列腺癌細(xì)胞共培養(yǎng)，ELISA 檢測(cè)TNF和IL-2分泌。
　　 結(jié)果：經(jīng)PCR及酶切鑒定，SEA基因成功克隆到病毒載體中，可以表達(dá)SEA基因，且病毒滴度為2.0×

4、1010pfu/ml。RT-PCR 檢測(cè)SG504-SEA 在腫瘤細(xì)胞內(nèi)不同時(shí)段mRNA的表達(dá)，瓊脂糖電泳252bp 處可見(jiàn)清晰條帶，轉(zhuǎn)染前列腺癌DU145 細(xì)胞在12、24、48小時(shí)持續(xù)表達(dá)SEA mRNA；免疫熒光定位DU145 細(xì)胞表面可以看到明顯的熒光表達(dá),可以確定SEA基因表達(dá)于前列腺腫瘤的細(xì)胞膜上,并且不同時(shí)段細(xì)胞表達(dá)熒光的亮度存在差別，隨著時(shí)間增加熒光表達(dá)逐漸增強(qiáng)；SDS-PAGE 電泳后用考馬斯亮藍(lán)染色顯示在27kDa

5、附近可看到明顯條帶,而未轉(zhuǎn)染細(xì)胞不存在。Western-blot 結(jié)果證實(shí)SEA蛋白的表達(dá)成功；淋巴細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)12、24、48h 實(shí)驗(yàn)組腫瘤細(xì)胞明顯少于對(duì)照組，表明DU145 細(xì)胞與淋巴細(xì)胞共同培養(yǎng)的過(guò)程中,轉(zhuǎn)染SEA基因的腫瘤細(xì)胞相對(duì)未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞更易被淋巴細(xì)胞捕獲殺傷，對(duì)淋巴細(xì)胞有一定的趨化作用；ELISA 檢測(cè)TNF和IL-2分泌量實(shí)驗(yàn)組均高于對(duì)照組。
　　 結(jié)論：成功構(gòu)建了表達(dá)超抗原SEA基因的雙調(diào)控選擇增殖型溶