microRNA參與腦腫瘤干細(xì)胞凋亡的研究.pdf_第1頁(yè)
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1、研究背景與目的:
   腫瘤干細(xì)胞(cancerstemcells)是存在于腫瘤中的一小部分具有干細(xì)胞性質(zhì)的細(xì)胞群體,它具有自我更新的能力,是形成不同分化程度的腫瘤細(xì)胞和腫瘤不斷擴(kuò)大的源泉。到目前為止,人們已成功的從造血系統(tǒng)惡性腫瘤、乳腺癌和腦腫瘤患者組織中分離并培養(yǎng)出各自的腫瘤干細(xì)胞。這證明在腫瘤細(xì)胞群體中確實(shí)存在一類(lèi)極少數(shù)的能使群體擴(kuò)增的腫瘤干細(xì)胞。
   腫瘤細(xì)胞具有異質(zhì)化的特性,即由一個(gè)克隆來(lái)源的腫瘤細(xì)胞在生長(zhǎng)過(guò)

2、程中,形成在侵襲能力、生長(zhǎng)速度、分化程度、對(duì)激素的反應(yīng)、對(duì)抗癌藥物的敏感性等方面有所不同的亞克隆。腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性的現(xiàn)象只有用腫瘤干細(xì)胞的理論才能解釋?zhuān)茨[瘤干細(xì)胞在不同選擇壓力下,向不同功能方向分化、成熟,造成腫瘤細(xì)胞的群體漂移,從而形成異質(zhì)性。因此,腫瘤干細(xì)胞是腫瘤的根源,消滅了腫瘤干細(xì)胞就意味著消滅了腫瘤。長(zhǎng)期以來(lái),人們發(fā)現(xiàn)實(shí)體瘤的缺氧程度與腫瘤的不良預(yù)后相關(guān)。傳統(tǒng)的腫瘤化療主要針對(duì)迅速增殖的瘤細(xì)胞,TSC在細(xì)胞群中增殖緩慢,對(duì)化療

3、不敏感,TSC的膜表面蛋白受HIFs的調(diào)控,在低氧環(huán)境中能高效地排除藥物,保護(hù)TSC不被殺滅,其對(duì)通過(guò)減少腫瘤細(xì)胞負(fù)載的治療方法有抗性,而TSC在缺氧的環(huán)境中也能得到更好的保護(hù)。缺氧的細(xì)胞對(duì)放療也不敏感,低氧是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的普遍特征,研究表明膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞放射抗性歸結(jié)于細(xì)胞DNA修復(fù)能力的增強(qiáng),提示在缺氧狀態(tài)下,癌癥干細(xì)胞的輻射抗性會(huì)顯著提高。因此不論是化療或是放療,缺氧都是腫瘤治療的重要靶點(diǎn)。
   miRNA在腫瘤發(fā)生、

4、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移中起重要作用,相關(guān)領(lǐng)域的研究已取得很多成果,為miRNA在腫瘤診斷和治療中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。但miRNA在腫瘤中表達(dá)失調(diào)的機(jī)制等問(wèn)題仍需要進(jìn)一步研究。隨著研究的深入,miRNA與腫瘤的關(guān)系必將得以闡明,miRNA在腫瘤防治中的應(yīng)用也必將會(huì)有更廣闊的前景,成為腫瘤治療的新策略。
   本研究應(yīng)用miRNA芯片從miRNA水平分析U87腫瘤干細(xì)胞缺氧后的改變,發(fā)現(xiàn)U87腫瘤干細(xì)胞缺氧后特異表達(dá)的miRNA。通過(guò)合成特

5、異miRNAmimic(miRNA寡核苷酸模擬物),轉(zhuǎn)染人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87腫瘤干細(xì)胞。運(yùn)用細(xì)胞和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行功能研究,為腦膠質(zhì)瘤提供發(fā)病機(jī)制提供新的思路,也為腦膠質(zhì)瘤的分子診斷和miRNA治療奠定基礎(chǔ)。
   研究方法:
   1.將U87細(xì)胞接種于含B27、肝素、表皮生長(zhǎng)因子、堿性成纖維生長(zhǎng)因子的無(wú)FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液中,在37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待U87細(xì)胞增殖形成細(xì)胞球3~4d

6、后,吸取上清培養(yǎng)液(含細(xì)胞球),重新吹打成單細(xì)胞懸液,按1:2或1:3比例傳代。原代細(xì)胞球形成并達(dá)到100~200個(gè)細(xì)胞后,收集其細(xì)胞球,以2%多聚甲醛固定,室溫15min;10%驢血清封閉10min,加入鼠抗人CD133—抗,4℃孵育過(guò)夜;加入Cy3標(biāo)記的兔抗小鼠二抗,室溫孵育2h,Hoechst33342染核。在顯微鏡下隨機(jī)選擇20個(gè)高倍視野進(jìn)行陽(yáng)性CSCs計(jì)數(shù)。缺氧狀態(tài)下的細(xì)胞培養(yǎng)使用缺氧細(xì)胞培養(yǎng)箱,培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2、

7、1%O2。應(yīng)用microRNA芯片芯片系統(tǒng)研究U87腫瘤干細(xì)胞具有缺氧相關(guān)的miRNAs。
   2.以缺氧與正常的U87腫瘤干細(xì)胞的總RNA為模版,使用兩部法熒光定量PCR方法,擴(kuò)增目的基因,同時(shí)設(shè)U6rRNA為內(nèi)參。反應(yīng)結(jié)束后,以U6rRNA為內(nèi)標(biāo),采用2-△△Ct方法來(lái)計(jì)算每種miRNA在的相對(duì)定量值。
   3.取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期U87腫瘤干細(xì)胞,計(jì)數(shù),無(wú)抗生素培養(yǎng)基重懸,按6孔板每孔接種3×105細(xì)胞,加培養(yǎng)基至2m

8、l,培養(yǎng)16-24h后轉(zhuǎn)染。合成特異miRNAmimic(miRNA寡核苷酸模擬物),轉(zhuǎn)染人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87腫瘤干細(xì)胞,RT-PCR檢測(cè)hsa-let-7i表達(dá)量,WesternBlot檢測(cè)轉(zhuǎn)染U87腫瘤干細(xì)胞Bcl-2、Caspase3、Caspase9蛋白的表達(dá),TUNEL檢測(cè)轉(zhuǎn)染hsa-let-7mimicU87腫瘤干細(xì)胞凋亡,流式細(xì)胞儀檢測(cè)miRNAmimics誘導(dǎo)凋亡。
   研究結(jié)果:
   1.應(yīng)用mic

9、roRNA芯片芯片系統(tǒng)研究U87腫瘤干細(xì)胞具有缺氧相關(guān)的miRNAs。
   經(jīng)Hy3熒光標(biāo)記、純化,進(jìn)行芯片雜交,圖像采集,數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理后,以?xún)煞N細(xì)胞Hy3熒光標(biāo)記信號(hào)強(qiáng)度的比值≤0.5或≥2為標(biāo)準(zhǔn)判定差異表達(dá)miRNA。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組U87腫瘤干細(xì)胞相比,處理組的U87腫瘤干細(xì)胞中,上調(diào)表達(dá)的miRNA有10個(gè),下調(diào)表達(dá)的miRNA有13個(gè)。處理組與對(duì)照組U87MG比較,細(xì)胞中下調(diào)表達(dá)的miRNAs為hsa-let

10、-7i、hsa-miR-29c、sv40-miR-S1-5p、hsa-miR-1290、hsa-miR-584、hsa-miR-625*、hsa-miR-1914、hsa-miRPlus-G1246-3p、hsa-miR-4279、hsv2-miR-H7-3p、hsa-miR-3679-3p、hsa-miR-3675-3p、hsa-miR-1246,上調(diào)表達(dá)的miRNAs是hsa-miR-143、hsa-miR-124、hsa-miR-

11、15a、hsa-miR-144、hsa-miR-9*、hsa-miR-33b、hsa-miR-24-1*、hsvl-miR-H4*、hsa-miR-4297、hsa-miR-3613-3p,其中hsa-let-7i、hsa-miR-143等多個(gè)有文獻(xiàn)報(bào)道與細(xì)胞增殖、腫瘤發(fā)生發(fā)展等密切相關(guān)。
   2.qRT-PCR方法對(duì)芯片結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)
   使用Agilent2100生物分析儀鑒定從干細(xì)胞中提取總RNA的質(zhì)量,分別測(cè)定

12、28S/18S峰值面積都在2:1左右,RNA的質(zhì)量符合熒光定量分析的要求。選取4種miRNA進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。反應(yīng)結(jié)束后,以U6為內(nèi)參,采用2-△△Ct方法來(lái)計(jì)算每種miRNA的在處理前后的相對(duì)定量值。hsa-miR-124上調(diào)10.82±1.17hsa-miR-143上調(diào)4.82±0.20hsa-let-7i下調(diào)2.04±0.08hsa-miR-29c下調(diào)1.96±0.01與芯片結(jié)果基本相同(芯片結(jié)果:hsa-miR-124上調(diào)

13、11.79441663倍,hsa-miR-143上調(diào)4.748774253倍,hsa-let-7i下調(diào)2.087019倍,hsa-miR-29c下調(diào)2.0929982倍)
   3.hsa-let-7imimics對(duì)U87腫瘤干細(xì)胞的生物學(xué)影響
   QRT-PCR檢測(cè)顯示轉(zhuǎn)染hsa-let-7imimics的U87腫瘤干細(xì)胞的hsa-let-7i的表達(dá)水平升高。流式細(xì)胞儀檢測(cè)hsa-let-7imimic轉(zhuǎn)染U87腫瘤

14、干細(xì)胞48小時(shí)后能誘導(dǎo)U87腫瘤干細(xì)胞的凋亡,各組間差異顯著(F=464.229,P=0.000),且各處理組與對(duì)照組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Westernblot結(jié)果顯示:Bcl-2的蛋白水平降低達(dá),Caspase3,Caspase9蛋白水平增強(qiáng)。Tunel檢測(cè)顯示DNA斷裂的凋亡細(xì)胞標(biāo)記有增強(qiáng)的熒光。說(shuō)明轉(zhuǎn)染hsa-let-7imimics可以誘導(dǎo)U87腫瘤干細(xì)胞的凋亡。
   結(jié)論:
   應(yīng)用micr

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