免疫增效抗前列腺癌DNA疫苗抑瘤活性的初步研究.pdf

1、研究背景：前列腺癌是威脅人類健康的重要疾病，特別進(jìn)展到雄激素非依賴期的前列腺癌目前仍然沒有特別有效的治療方法。免疫治療很可能成為治療前列腺癌的很有前景的一種方法。DNA疫苗作為免疫治療的一種方式，已經(jīng)在臨床前和臨床實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行了廣泛的研究，DNA疫苗具有安全性好、特異性高以及易于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)等方面的優(yōu)勢正在成為前列腺癌免疫治療的重要發(fā)展方向。但是，DNA疫苗也存在轉(zhuǎn)染效率低下，誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)較弱的缺點(diǎn)，本研究我們通過對靶抗原的選擇，佐劑的應(yīng)

2、用以及遞送方式的改進(jìn)等方面來加強(qiáng)DNA疫苗誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)，為前列腺癌DNA疫苗的免疫增效進(jìn)行探索性研究。
　　研究目的：本研究將前列腺干細(xì)胞抗原（PSCA）和免疫佐劑IL-12共同構(gòu)建到同一真核表達(dá)載體中成為新型的前列腺癌DNA疫苗pVAX1-mPSCA-IRES-mIL-12，通過電穿孔的方法遞送疫苗到小鼠體內(nèi)，觀察DNA疫苗的抑瘤效果并對其可能的免疫學(xué)機(jī)制進(jìn)行初步的探討。
　　方法：
　　1.將PCR方法擴(kuò)增的mI

3、L-12基因其克隆到pVAX1-IRES載體中IRES序列的下游構(gòu)建免疫增效載體pVAX1-IRES-mIL-12，在此基礎(chǔ)上將RT-PCR方法從RM-1細(xì)胞系中擴(kuò)增的mPSCA基因克隆到該質(zhì)粒IRES的上游，構(gòu)建前列腺癌DNA疫苗pVAX1-mPSCA-IRES-mIL-12。質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后分別通過WesternBlot驗(yàn)證mPSCA的表達(dá)，ELISA法驗(yàn)證mIL-12的真核表達(dá)；電穿孔法遞送質(zhì)粒到小鼠體內(nèi)驗(yàn)，分別驗(yàn)證mP

4、SCA和mIL-12基因的活體內(nèi)表達(dá)。本部分中還構(gòu)建了pVAX1-mPSCA質(zhì)粒作為新的DNA疫苗的對照，驗(yàn)證了其體內(nèi)外的表達(dá)情況。
　　2.將mPSCA基因去除信號肽后構(gòu)建到原核表達(dá)載體pet-42a中，IPTG誘導(dǎo)并純化mPSCA蛋白，通過WesternBlot和ELISA檢測純化后的mPSCA蛋白的免疫原性。
　　3.將所構(gòu)建的DNA疫苗采用電穿孔肌肉內(nèi)注射的方式免疫小鼠，觀察所構(gòu)建的DNA疫苗的抑瘤效果，并對其相關(guān)的

5、免疫學(xué)機(jī)制進(jìn)行初步的研究：采用ELISA檢測免疫小鼠血清中的特異抗體滴度和血清中的細(xì)胞因子的水平；采用LDH法體外檢測免疫小鼠細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）反應(yīng)；采用ELISPOT法檢測免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞特異性IFN-γ的分泌；采用流式細(xì)胞術(shù)檢測免疫小鼠的離體腫瘤組織內(nèi)的腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞；對全身其他器官進(jìn)行病理組織切片染色（HE）觀察疫苗免疫后小鼠其他組織有無炎癥反應(yīng)和組織損傷。
　　結(jié)果：
　　1.酶切及測序結(jié)果證實(shí)成功構(gòu)建

6、了pVAX1-IRES-mIL-12、pVAX1-mPSCA和pVAX1-mPSCA-IRES-mIL-12質(zhì)粒，并且證實(shí)了各個(gè)質(zhì)粒在體外和體內(nèi)均可以有效表達(dá)。
　　2.酶切和測序結(jié)果證實(shí)成功構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET-42a-mPSCA，誘導(dǎo)并純化出大小約為40KD的融合蛋白；WesternBlot和ELISA檢測顯示純化后的mPSCA蛋白具有免疫原性。
　　3.觀察不同質(zhì)粒免疫后的小鼠移植瘤生長趨勢，發(fā)現(xiàn)與對照組相比DNA疫

7、苗組成瘤時(shí)間延長3d；疫苗組小鼠腫瘤生長受到明顯抑制，腫瘤抑制率達(dá)77.96％。DNA疫苗組小鼠體內(nèi)產(chǎn)生的特異性抗體滴度大于12800；可以檢測到疫苗組小鼠血清細(xì)胞因子IL-12和IFN-γ的增加，淋巴細(xì)胞特異性的IFN-γ的分泌達(dá)2430.00±157.36SFU/106個(gè)脾淋巴細(xì)胞；疫苗組淋巴細(xì)胞與對照組相比對腫瘤細(xì)胞的殺傷效率明顯增加，在效靶比為40:1、20:1和10:1時(shí)，CTL的殺傷率分別為33.19±0.24%、26.67

8、±0.73%和20.44±0.26%。在疫苗組免疫的小鼠腫瘤組織中可以檢測到CD8+T細(xì)胞的浸潤。疫苗免疫后小鼠中低量表達(dá)PSCA抗原的正常組織病理切片中沒有發(fā)現(xiàn)自身免疫性炎癥反應(yīng)和組織損傷的證據(jù)。
　　結(jié)論：本研究在靶抗原的選擇、佐劑的應(yīng)用、DNA遞送方式等方面為DNA疫苗的免疫增效研究做出了新的嘗試。所構(gòu)建的新型免疫增效DNA疫苗pVAX1-mPSCA-IRES-mIL-12與其他對照組相比在小鼠體內(nèi)可以誘導(dǎo)產(chǎn)生更強(qiáng)的特異性細(xì)