COX-2對(duì)乳腺癌轉(zhuǎn)移及放化療抵抗的調(diào)節(jié)及其機(jī)理.pdf

1、第一部分 COX-2對(duì)乳腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的促進(jìn)作用及其機(jī)理
　　目的:研究環(huán)氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）在人乳腺癌中的組成性表達(dá)及其在乳腺癌增殖、克隆形成、遷移及侵襲等方面發(fā)揮的作用，以及導(dǎo)致上述乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為變化的可能機(jī)制;通過(guò)動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)探索COX-2對(duì)乳腺癌細(xì)胞成瘤和轉(zhuǎn)移能力的影響及其作用機(jī)制。
　　方法:采用RT-PCR檢測(cè)9種人乳腺癌細(xì)胞系(MCF-7、T47D、SKBR3、

2、ZR-75-30、Bcap-37、MDA-MB-468、MDA-MB-231、MDA-MB-231HM、MDA-MB-231BO)和1種正常乳腺上皮細(xì)胞系(MCF-10A)中COX-2的基因表達(dá)水平，通過(guò)慢病毒感染成功構(gòu)建COX-2基因沉默細(xì)胞系MDA-MB-231-COX-2i(簡(jiǎn)稱(chēng)231-COX-2i)、231HM-COX-2i及231BO-COX-2i;通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒感染成功構(gòu)建COX-2過(guò)表達(dá)細(xì)胞系MCF7-COX-2、SKBR

3、3-COX-2及231-COX-2;采用CCK-8法、軟瓊脂克隆實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell法分析COX-2基因沉默組和過(guò)表達(dá)組細(xì)胞較對(duì)照組細(xì)胞增殖、克隆形成、細(xì)胞遷移及侵襲性的改變，并用Westernblot法探討其可能機(jī)理。取Balb/c小鼠每組5只，在乳腺脂肪墊(mammary fat pad，mfp)分別接種COX-2表達(dá)沉默和過(guò)表達(dá)組細(xì)胞及其對(duì)照組細(xì)胞，觀察移植瘤大小、體積及肺轉(zhuǎn)移數(shù)目。
　　結(jié)果:RT-PCR結(jié)果

4、顯示具有高轉(zhuǎn)移傾向的MDA-MB-231HM和MDA-MB-231BO細(xì)胞中COX-2的表達(dá)相較于轉(zhuǎn)移能力弱或無(wú)轉(zhuǎn)移能力的細(xì)胞中顯著增高。Western blot結(jié)果驗(yàn)證了COX-2表達(dá)沉默和過(guò)表達(dá)細(xì)胞系的成功建立。與對(duì)照組相比，COX-2過(guò)表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞增殖、克隆形成、遷移及侵襲，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性意義(p＜0.05); COX-2表達(dá)沉默組反之。Western blot結(jié)果顯示COX-2導(dǎo)致的上述生物學(xué)行為的改變可能與PI3

5、K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活有關(guān)。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，COX-2過(guò)表達(dá)或表達(dá)沉默組的移植瘤大小、體積及肺轉(zhuǎn)移數(shù)目與對(duì)照組移植瘤的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性意義(p＜0.01)。
　　結(jié)論:體外及體內(nèi)研究的結(jié)果均表明，COX-2可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移，其機(jī)理可能與PI3K/AKT信號(hào)通路激活有關(guān)。
　　第二部分 COX-2在乳腺癌化療藥物敏感性中的作用及其機(jī)理
　　目的:固有或獲得性的化療抵抗已經(jīng)成為多種腫瘤包括乳腺癌治療

6、失敗的主要原因，化療抵抗可導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。然而，化療抵抗的具體機(jī)制尚不明確。本文旨在研究COX-2在乳腺癌細(xì)胞吉西他濱(吉西他濱，Gemcitabine，Gem)化療抵抗中的作用，并探討其可能機(jī)理。
　　方法:構(gòu)建乳腺癌化療抵抗細(xì)胞系MDA-MB-231 Gem，使用COX-2 shRNA抑制MDA-MB-231 Gem中COX-2的基因表達(dá)。利用MTT及流式細(xì)胞術(shù)，檢測(cè)IC50及加藥后凋亡的變化。蛋白表達(dá)水平通過(guò)wester

7、n blot分析。
　　結(jié)果:加入同等劑量的吉西他濱后，過(guò)表達(dá)COX-2組的細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組細(xì)胞明顯降低，而COX-2表達(dá)沉默組較對(duì)照組的細(xì)胞凋亡率顯著增高。在MDA-MB-231 Gem細(xì)胞中我們發(fā)現(xiàn)COX-2的表達(dá)明顯上調(diào)。進(jìn)一步的機(jī)理研究發(fā)現(xiàn)，在COX-2基因沉默的MDA-MB-231 Gem細(xì)胞中，p53的表達(dá)無(wú)明顯變化，而p53在磷酸化位點(diǎn)Ser15上明顯活化，Bcl-2、Bcl-XL及Xiap的表達(dá)下降，從而導(dǎo)致化療

8、后的細(xì)胞凋亡數(shù)目的增加。
　　結(jié)論:我們的結(jié)果顯示，靶向沉默COX-2可以增加乳腺癌細(xì)胞對(duì)化療的敏感性，這與p53介導(dǎo)的凋亡信號(hào)通路激活密切相關(guān)，提示COX-2可能成為化療抵抗乳腺癌的潛在治療靶點(diǎn)。
　　第三部分 COX-2在乳腺癌放射治療敏感性中的作用及其機(jī)理
　　目的:放療抵抗是乳腺癌治療中主要的難點(diǎn)之一。COX-2通常在高轉(zhuǎn)移傾向的乳腺癌中呈高表達(dá)，這提示其可能參與乳腺癌放療抵抗。本文旨在研究COX-2在乳腺癌放

9、療抵抗中的作用及其可能機(jī)制。
　　方法:構(gòu)建乳腺癌放療抵抗細(xì)胞系MDA-MB-231RR10，使用COX-2 shRNA使MDA-MB-231RR10中COX-2的基因沉默。利用CCK8法、劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)及流式細(xì)胞術(shù)，檢測(cè)細(xì)胞在增殖、遷移、侵襲、克隆形成能力及凋亡等生物學(xué)行為方面的的變化。蛋白和mRNA水平變化分別由Western blot及實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)行分析。
　　結(jié)果:COX-2在

10、MDA-MB-231RR10細(xì)胞中的表達(dá)上調(diào)。在COX-2基因沉默的MDA-MB-231RR10中可見(jiàn)Bcl-2、Bcl-XL表達(dá)下降，而B(niǎo)AK的表達(dá)升高，進(jìn)而導(dǎo)致放療后的細(xì)胞凋亡數(shù)目明顯增加;同時(shí)，β-catenin和E-cadherin的表達(dá)增加，從而導(dǎo)致劃痕和Transwell實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞遷移及侵襲數(shù)目的減少。進(jìn)一步研究證實(shí)，COX-2介導(dǎo)的放療抵抗由p38在Tyr182的磷酸位點(diǎn)活化負(fù)性調(diào)節(jié);通過(guò)TNF-α活化p38能減少Bcl-