青蒿琥酯抗小鼠中暑內(nèi)毒素血癥及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的研究.pdf

1、研究背景：內(nèi)毒素血癥是中暑重要的病理生理過(guò)程，其防治一直是研究的熱點(diǎn)內(nèi)容。近年來(lái)，隨著對(duì)內(nèi)毒素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路研究的不斷深入和清晰，內(nèi)毒素血癥的治療手段正逐漸轉(zhuǎn)到影響其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中關(guān)鍵受體分子表達(dá)的方向上來(lái)。青蒿琥酯是近來(lái)發(fā)現(xiàn)有良好的抗外源性內(nèi)毒素血癥效果的藥物，但它在中暑領(lǐng)域的應(yīng)用國(guó)內(nèi)外尚屬空白，因此，探討青蒿琥酯對(duì)內(nèi)源性中暑內(nèi)毒素血癥的作用以及對(duì)內(nèi)毒素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響，能清楚的了解藥物的作用機(jī)制，更好的為該類(lèi)藥物在中暑內(nèi)毒素血癥的防

2、治應(yīng)用中奠定基礎(chǔ)。 目的：探討青蒿琥酯對(duì)中暑內(nèi)毒素血癥的作用及其可能的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，為其在防治中暑內(nèi)毒素血癥中的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。 方法：實(shí)驗(yàn)分為兩個(gè)部分。第一部分：青蒿琥酯在中暑內(nèi)毒素血癥小鼠中的作用。昆明小鼠隨機(jī)分為高溫組、生理鹽水組和青蒿琥酯組(按小鼠體重腹腔注射給藥)，其中青蒿琥酯組又按不同的給藥方式和給藥濃度分為三組，分別為一次性給藥80mg/kg組和連續(xù)5天給藥的40mg/kg組與60mg/kg組，生理鹽水組

3、按對(duì)照的藥物組濃度給藥。最后一次給藥后，各組均在人工熱氣候模擬艙內(nèi)熱暴露，保持干球溫度(Tdb)(35±0.5)℃和相對(duì)濕度(RH)(65±5)％的條件，每30min測(cè)量肛溫一次，觀察各組小鼠的存活時(shí)間。同時(shí)取高溫2h組、生理鹽水60mg/kg2h組和青蒿琥酯60mg/kg2h組的肝組織標(biāo)本，透射電鏡觀察肝組織的病理變化。第二部分：青蒿琥酯抗中暑內(nèi)毒素血癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的研究。此部分亦分為兩個(gè)實(shí)驗(yàn)：1.青蒿琥酯對(duì)內(nèi)毒素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中CD1

4、4和TLR4mRNA表達(dá)的影響。昆明小鼠隨機(jī)分為常溫組、高溫組、生理鹽水組和青蒿琥酯60mg/kg組(按小鼠體重連續(xù)5天腹腔注射給藥)，之后常溫組在Tdb(25±0.5)℃、RH(43±5)％條件下暴露2h；其它組的熱暴露氣象條件同第一部分，誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生中暑內(nèi)毒素血癥，均分1、2h兩個(gè)觀察時(shí)段，到觀察時(shí)間采血，分離腹腔巨噬細(xì)胞，用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)血漿中腫瘤壞死因子a(TNF-a)的分泌量，用反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)

5、檢測(cè)腹腔巨噬細(xì)胞內(nèi)CD14和TLR4mRNA的表達(dá)水平。2.青蒿琥酯對(duì)中暑內(nèi)毒素血癥小鼠腹腔巨噬細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度的影響。昆明小鼠隨機(jī)分為常溫組、高溫組和青蒿琥酯60mg/kg組(方法同前)，常溫組在Tdb(25±0.5)℃、RH(43±5)％條件下暴露2h，另外兩組在與第一部分相同的氣象條件下暴露2h，之后立即分離腹腔巨噬細(xì)胞，采用Fluo-3/AM負(fù)載及流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度。 結(jié)果：第一部分：青蒿琥酯在中暑內(nèi)

6、毒素血癥小鼠中的作用。一次性給藥實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，高溫組、生理鹽水組和青蒿琥酯80mg/kg組小鼠的平均存活時(shí)間分別為(91.7±11.9)min、(96.9±12.5)min和(102.9±15.3)min，肛溫上升速率分別為(0.057±0.009)℃/min、(0.056±0.007)℃/min和(0.047±0.008)℃/min;生理鹽水組小鼠雖在存活時(shí)間和肛溫上升速率上較高溫組稍好，但二組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；一次性給予青蒿琥酯80m

7、g/kg組與高溫組比較，小鼠的存活時(shí)間明顯延長(zhǎng)(P＜0.05)，肛溫上升速率也顯著降低(P＜0.01)；藥物組雖與生理鹽水組在存活時(shí)間上無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但肛溫上升速率比較P＜0.05，說(shuō)明青蒿琥酯對(duì)中暑內(nèi)毒素血癥小鼠確有保護(hù)作用。連續(xù)5天給藥對(duì)小鼠的保護(hù)作用就更加明顯，青蒿琥酯40mg/kg組和60mg/kg組小鼠的平均存活時(shí)間分別為(111.1±12.8)min和(126.7±17.9)min，與高溫組(93.8±12.5)min和生理

8、鹽水組(96.5±15.3)min相比，藥物組小鼠的存活時(shí)間均明顯延長(zhǎng)，以青蒿琥酯60mg/kg組為著，且均P＜0.01；在肛溫上升速率上，高溫組和生理鹽水組分別為(0.055±0.008)℃/min和(0.052±0.005)℃/min，青蒿琥酯40mg/kg組和60mg/kg組則分別為(0.043±0.004)℃/min和(0.039±0.005)℃/min，兩個(gè)藥物組的肛溫上升速率明顯降低，青蒿琥酯40mg/kg組與兩個(gè)對(duì)照組比較

9、均P＜0.05，60mg/kg組則均P＜0.01，這進(jìn)一步證實(shí)了青蒿琥酯對(duì)中暑內(nèi)毒素血癥小鼠的保護(hù)作用；生理鹽水組與高溫組間亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說(shuō)明生理鹽水對(duì)中暑小鼠的保護(hù)作用不理想。單獨(dú)將三個(gè)藥物組比較發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是存活時(shí)間還是肛溫上升速率，連續(xù)5天給藥效果均好于一次性給藥效果；在連續(xù)5天給藥中，青蒿琥酯60mg/kg濃度效果又優(yōu)于40mg/kg濃度。同時(shí)，肝組織電鏡照片觀察到，高溫2h組和生理鹽水2h組肝細(xì)胞核均有皺縮，核內(nèi)染色體聚集成塊

10、狀，核膜不整，胞漿基質(zhì)密度低，線粒體腫脹、變形，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張、數(shù)量減少，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)崩解；而青蒿琥酯60mg/kg2h組的肝細(xì)胞無(wú)明顯異常，核膜完整，染色體分布均勻，細(xì)胞器數(shù)量未見(jiàn)明顯減少，僅內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有輕度擴(kuò)張，線粒體有部分腫脹，進(jìn)一步說(shuō)明了青蒿琥酯對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用。 第二部分：青蒿琥酯抗中暑內(nèi)毒素血癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的研究。1.青蒿琥酯對(duì)內(nèi)毒素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中CD14和TLR4mRNA表達(dá)的影響。與常溫組的水平相比，高溫組1、2h的CD1

11、4和TLR4mRNA表達(dá)水平均顯著升高(P＜0.01)，并呈現(xiàn)出隨時(shí)間升高的趨勢(shì)。生理鹽水組1h的CD14和TLR4mRNA表達(dá)亦顯著升高(P＜0.01)，但在2h時(shí)均有輕度下降，呈現(xiàn)出隨時(shí)間下降的趨勢(shì)，CD14在2h的表達(dá)量與同組1h水平相比P＜0.05，與高溫組2h水平相比P＜0.01，而TLR4在2h的表達(dá)量與同組1h水平間無(wú)顯著性差異，但與高溫組2h水平相比P＜0.01。青蒿琥酯60mg/kg組1、2h的CD14和TLR4mRN

12、A表達(dá)均明顯降低，低于常溫組的水平，并呈現(xiàn)出隨時(shí)間輕微下降的趨勢(shì)，與常溫組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但與高溫組和生理鹽水組的同時(shí)段比較均P＜0.01，表明青蒿琥酯能夠明顯降低內(nèi)毒素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中CD14和TLR4兩個(gè)關(guān)鍵受體分子的表達(dá)。同時(shí)，各組血漿中TNF-a的分泌量呈現(xiàn)出與兩個(gè)分子同樣的變化趨勢(shì)。高溫組兩個(gè)時(shí)段的TNF-a分泌量是顯著增加的，與常溫組比較均P＜0.01；生理鹽水組亦是在1h時(shí)TNF-a顯著升高而2h時(shí)輕度降低，均與常溫組比較

13、P＜0.01，但生理鹽水2h水平與高溫組2h的TNF-a的分泌量比較P＜0.01。青蒿琥酯組1、2h的TNF-a分泌量有輕度升高，同組內(nèi)及與常溫組間比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但與其他組同時(shí)段比較均P＜0.01，表明青蒿琥酯能減少血漿中TNF-a的分泌量。2.青蒿琥酯對(duì)中暑內(nèi)毒素血癥小鼠腹腔巨噬細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度的影響。常溫組、高溫組和青蒿琥酯60mg/kg組的細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子熒光強(qiáng)度分別為(3.30±0.67)、(14.26±1.79)和(

14、5.28±0.49)，與常溫組比較，高溫組細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度顯著升高(P＜0.01)，藥物組細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度僅有輕度升高，與常溫組比較P＜0.05，與高溫組比較P＜0.01，表明在中暑內(nèi)毒素血癥時(shí)細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度是明顯升高的，青蒿琥酯則能抑制細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度的大幅上升。 結(jié)論：1.首次證實(shí)青蒿琥酯具有對(duì)中暑內(nèi)毒素血癥小鼠良好的保護(hù)作用，它能延長(zhǎng)小鼠的存活時(shí)間，降低其肛溫上升速率；有利于保持小鼠細(xì)胞內(nèi)部正常結(jié)構(gòu)、維持

15、細(xì)胞器的數(shù)量和功能。 2.青蒿琥酯的不同給藥方式和給藥濃度對(duì)中暑內(nèi)毒素血癥小鼠的保護(hù)作用存在差異，連續(xù)5天給藥效果優(yōu)于一次性大劑量給藥效果，而連續(xù)5天給予青蒿琥酯60mg/kg效果最佳。 3.中暑內(nèi)毒素血癥時(shí)，LPS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上CD14和TLR4分子的表達(dá)顯著增加，細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度亦明顯升高，導(dǎo)致血漿中TNF-a含量增加；青蒿琥酯則能明顯下調(diào)CD14和TLR4的表達(dá)，降低細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度，減少TNF-a的分泌。

16、 4.在LPS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，TLR4是CD14下游的關(guān)鍵跨膜分子，兩者在中暑內(nèi)毒素血癥時(shí)的表達(dá)變化趨勢(shì)的一致性說(shuō)明：在LPS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，某個(gè)上游分子的表達(dá)變化會(huì)使與其相聯(lián)系的、發(fā)揮同樣作用的下游分子亦發(fā)生相同的變化，以利于提高信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的協(xié)調(diào)性和高效性，擴(kuò)大LPS的生物學(xué)效應(yīng)。5.細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度和血漿中TNF-a含量的變化與CD14和TLR4的變化趨勢(shì)相同，說(shuō)明整個(gè)LPS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)是協(xié)調(diào)的。 6.青蒿琥