整合素ανβ6及CIP2A對結腸癌細胞惡性行為的調控作用.pdf

1、研究背景：
　　整合素αvβ6作為一種只在發(fā)生惡性病變的上皮組織中表達的粘附因子，目前在結腸癌、乳腺癌、胰腺癌以及口咽部癌中的研究已經取得了重要的成果，尤其是在結腸癌方面的研究，更加深入細致;并且證實，αvβ6在上述惡性腫瘤中對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤及轉移方面起到重要的促進作用。CIP2A是PP2A的癌性抑制因子。迄今為止，已經發(fā)現(xiàn)CIP2A在胃癌、頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC)、非小細胞肺癌(NSCLC)、乳腺癌、口腔癌(OSC

2、C)、前列腺癌、肝癌、宮頸癌、急慢性白血病、舌癌及關節(jié)炎等惡性腫瘤和增生中過表達，其與腫瘤發(fā)生具有良好的相關性。c-Myc是體內重要的轉錄因子，在細胞增殖、分化、凋亡及血管形成過程中起重要作用。c-Myc在人類多種癌癥形成過程中作為重要的致癌因子。一些研究表明c-Myc調節(jié)失控與多種腫瘤的形成有關。CIP2A直接與內源性c-Myc的氨基端結合，在人類癌細胞中CIP2A通過抑制PP2A對c-Myc絲氨酸62位的去磷酸化作用進而促進c-My

3、c穩(wěn)定。結腸癌是人類常見的惡性腫瘤之一，預后很差;目前在我國，其發(fā)病率及死亡率居全部惡性腫瘤前列。因此，尋找一種有效地治療結腸癌的手段，已成為醫(yī)學工作者迫在眉睫的任務。本研究即旨在研究αvβ6、CIP2A與c-Myc三者在結腸癌是否存在相互作用，并藉此尋求治療結腸癌的有效靶點。
　　第一部分、CIP2A與c-Myc在結腸癌組織中的表達及意義
　　目的：檢測蛋白質磷酸酶2A(Protein phosphatae2A，PP2A)

4、的癌性抑制因子(Cancerous inhibitor of protein phosphatase2A，CIP2A)和c-Myc在結腸癌組織及正常結腸組織中的表達，分析二者在結腸癌組織中表達的相關性，探討CIP2A和c-Myc與結腸癌臨床病理特征的關系。
　　方法：
　　選擇煙臺市煙臺山醫(yī)院80例結腸癌病人的手術病理標本及20例正常結腸組織，制作組織芯片，行CIP2A與c-Myc的免疫組化染色;回顧性分析病人的臨床病例資料

5、，結合免疫組化結果，分析CIP2A與c-Myc在結腸癌組織中的表達的相關性，分析CIP2A和c-Myc與結腸癌臨床病理資料之間的關系。
　　結果：
　　1.CIP2A在結腸癌組織中的整體表達率約為87.5％，明顯高于正常結腸組織(30％，P=0.000);其表達與病人的年齡、性別、腫瘤的大?。═分期）、有無遠處轉移（M分期）以及TNM分期無明顯關系（P值分別為0.866、0.864、0.856、0.636及0.973），而與

6、腫瘤的分化程度、有無淋巴結轉移（N分期）相關(P值分別為0.011、0.001)。
　　2.c-Myc在結腸癌組織中的整體表達率約為76.25％，明顯高于正常結腸組織(45％，P=0.006)。c-Myc表達同樣與病人的年齡、性別、腫瘤的大小（T分期）、有無遠處轉移（M分期）以及TNM分期無明顯關系(P值分別為0.59、0.623、0.843、0.173及0.759)，而與腫瘤的分化程度、有無淋巴結轉移（N分期）相關(P值分別為0

7、.002、0.001)。
　　3.在80例結腸癌組織中CIP2A與c-Myc表達呈正相關性(rk=0.411，P=0.009)。
　　結論及意義：
　　揭示了CIP2A與c-Myc在結腸癌組織中的表達情況及其與各臨床病理特點之間的關系，豐富了結腸癌研究的理論知識，并為靶向治療結腸癌的研究提供了確切的理論依據(jù)。
　　第二部分、整合素αvβ6在結腸癌組織中的表達及與CIP2A的相關性研究
　　目的：研究整合素α

8、vβ6在結腸癌組織中的表達情況，αvβ6與結腸癌臨床病理特征的關系，以及αvβ6與CIP2A的相關性。
　　方法：
　　收集煙臺市煙臺山醫(yī)院80例結腸癌手術標本及其病人的臨床病理資料，經病理染色證實后構建組織芯片，免疫組化方法檢測整合素αvβ6的表達，分析其表達與臨床病理資料間的關系，并進一步研究整合素αvβ6與CIP2A蛋白的相關性。
　　結果：
　　整合素αvβ6在結腸癌組織中的表達率約為42.5％;其表達與

9、性別、年齡、腫瘤的大小、有無遠處轉移無明顯關系（P值分別為0.946、0.837、0.907及0.949），而與腫瘤的分化程度、有無淋巴結轉移以及TNM分期相關（P值分別為0.006、0.019及0.002）。利用Kendall's tau-b等級相關性檢驗得出，αvβ6與CIP2A在結腸癌組織的表達呈正相關（rk=0.248，P=0.011）。
　　結論及意義：
　　揭示了整合素αvβ6在結腸癌組織中的表達情況及其與各臨床

10、病理特點之間的關系，明確了αvβ6和CIP2A在結腸癌組織的表達呈正相關，深化了關于整合素αvβ6的理論研究，并為以αvβ6為靶點進行結腸癌靶向治療提供了可靠的理論與實驗依據(jù)。
　　第三部分、整合素αvβ6在結腸癌細胞增殖和凋亡中的作用及Baicalin對αvβ6表達的影響
　　目的：探討整合素αvβ6在結腸癌HT-29細胞增殖和凋亡等惡性生物學行為中的作用及相關機制;研究Baicalin對結腸癌αvβ6表達的影響。

11、　　方法：
　　培養(yǎng)細胞至對數(shù)生長期后分3組處理。對照組:不做特殊處理;10D5組:收集細胞重懸于RPMI1640中，向細胞懸液加入αvβ6單克隆抗體10D5，使其終濃度為0.1mg/mL，冰浴30min使其充分作用后置培養(yǎng)箱培養(yǎng)6h，PBS清洗終止反應;IgG2a組:用10D5陰性對照劑鼠IgG2a以相同濃度處理，方法同10D5組。MTT法檢測細胞增殖，流式細胞儀檢測細胞凋亡，Western blotting檢測caspase-

12、3蛋白的表達情況以研究整合素αvβ6在結腸癌HT-29細胞增殖和凋亡中的作用。
　　結果：
　　1.經MTT法檢測，用10D5封閉αvβ6后，細胞的存活率下降至（69.19±6.5）％（P＜0.05），而IgG2a處理組（98.25±1.4）％與對照組相比無明顯差異(P＞0.05)。
　　2.用流式細胞儀檢測各組細胞并用WinMDI2.9軟件分析得出，對照組、10D5組、IgG2a組的凋亡率分別為（3.4±1.3）％、

13、（14.77±2.0）％、（3.08±0.6）％。10D5組細胞的凋亡率與對照組相比明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05); IgG2a組和對照組相比無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。
　　3.經半定量光密度分析，caspase-3表達水平組間差異有統(tǒng)計學意義，10D5組表達水平大于對照組（P＜0.05）。IgG2a組與對照組相比，caspase-3表達水平無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。
　　4.經流式細胞術分析，Baica

14、lin可顯著降低結腸癌αvβ6表達，并可能藉此發(fā)揮抗癌作用。
　　結論及意義：
　　結腸癌HT-29細胞表面的αvβ6被特異性抗體封閉后，細胞增殖減慢，凋亡增加，caspase-3表達水平上調。表明αvβ6在HT-29細胞增殖和抗凋亡過程中發(fā)揮作用。另外，Baicalin可顯著降低結腸癌αvβ6表達。綜上，本實驗證實了整合素αvβ6在結腸癌HT-29細胞增殖和凋亡等惡性生物學行為中的作用，簡單探討了其作用機制，為結腸癌機制研