加速漢坦病毒疫苗免疫保護(hù)過(guò)程及其作用機(jī)理研究.pdf

1、本文以漢坦病毒滅活疫苗(流行性出血熱疫苗)和DNA疫苗為研究模型，綜合考慮疫苗類(lèi)型、免疫間隔、免疫劑量等因素并采取不同的免疫方案，通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)疫苗免疫后免疫應(yīng)答時(shí)間、效果的影響進(jìn)行探討，旨在初步闡明滅活疫苗和DNA疫苗誘導(dǎo)的免疫保護(hù)在時(shí)間、效果等方面的差異，并選擇漢坦病毒DNA疫苗，進(jìn)一步探討了其加速漢坦病毒疫苗產(chǎn)生免疫保護(hù)的策略及其機(jī)制，探索建立快速免疫的基礎(chǔ)理論和方法。全文包括三大部分： 第一部分：以漢坦病毒滅活疫苗(流行

2、性出血熱疫苗)和DNA疫苗為研究模型，采取不同免疫方案(免疫間隔、免疫劑量)對(duì)漢坦病毒滅活疫苗和DNA疫苗兩種疫苗免疫后誘導(dǎo)免疫應(yīng)答產(chǎn)生的時(shí)間、免疫保護(hù)效果等進(jìn)行了探討。兩種疫苗均采用肌肉注射途徑免疫小鼠，設(shè)立間隔1周快速免疫和間隔2周常規(guī)免疫兩種免疫方案，DNA疫苗為表達(dá)漢灘病毒84Fli株核蛋白與糖蛋白的pcDNA3.0/S和pcDNA3.0/M兩種質(zhì)粒等量混合，分為小劑量(20μg)、中劑量(50μg)和大劑量(100μg)三種不

3、同劑量免疫組。本研究完成了漢坦病毒滅活疫苗、漢坦病毒DNA疫苗不同劑量快速免疫和常規(guī)免疫方案的免疫效果評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)漢坦病毒滅活疫苗快速免疫方案能夠更快的誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較強(qiáng)的體液免疫應(yīng)答；漢坦病毒DNA疫苗大劑量(100μg)免疫較小劑量(20μg)和中劑量在誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答方面的效果最好；與滅活疫苗快速免疫組相比，DNA疫苗大劑量免疫組能夠較快的誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較強(qiáng)的體液免疫應(yīng)答；兩種疫苗均能有效誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生中和抗體，但DNA疫苗在誘導(dǎo)細(xì)胞免疫

4、應(yīng)答方面具有顯著的優(yōu)勢(shì)；漢坦病毒DNA疫苗大劑量免疫以及間隔1周的快速免疫方案在加速漢坦病毒疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫保護(hù)方面具有明顯的優(yōu)勢(shì)。 第二部分：根據(jù)抗原呈遞細(xì)胞(APCs)靶向策略，選擇與APCs表面。B7配體具有很高的親和力的細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4胞外區(qū)結(jié)構(gòu)域(extra-domain of cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4，eCTLA4)，構(gòu)建了表達(dá)eCTLA4與漢灘

5、病毒84Fli株病毒核蛋白(NP)或糖蛋白(GP)融合蛋白的抗原靶向性嵌合DNA疫苗載體pcDNA3.0/eCTLA4-S和pcDNA3.0/eCTLA4-M(pCMS)，并聯(lián)合應(yīng)用CpG motifs佐劑，進(jìn)一步探討eCTLA-4和CpG motifs加速漢坦病毒核酸疫苗產(chǎn)生免疫保護(hù)的效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)中采用了不同的免疫方案：pcDNA3.0/S和pcDNA3.0/M聯(lián)合CpG佐劑組(pMS+CpG組)；pcDNA3.0/S和pcDNA3.0

6、/M組(pMS組)；pcDNA3.0/eCTLA4-S和pcDNA3.0/eCTLA4-M聯(lián)合CpG佐劑組(pCMS+CpG組)；pcDNA3.0/eCTIA4-S和pcDNA3.0/eCTIA4-M組(pCMS組)。本研究通過(guò)對(duì)不同免疫方案DNA疫苗免疫保護(hù)效果的評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)eCTLA-4靶向與CpG motifs聯(lián)合免疫組(pCMS+CpG組)能有效誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生漢坦病毒特異性的體液免疫及細(xì)胞免疫反應(yīng)，而且無(wú)論在特異性體液免疫應(yīng)答產(chǎn)生的

7、時(shí)間和強(qiáng)度以及細(xì)胞免疫水平方面都要顯著優(yōu)于其它實(shí)驗(yàn)組(p<0.05)；pCMS免疫組與無(wú)eCTLA-4靶向的pMS免疫組相比，小鼠的細(xì)胞免疫水平明顯增強(qiáng)；體液免疫方面，pCMS免疫組與無(wú)eCTLA-4靶向的兩個(gè)免疫組(pMS，pMS+CpG)相比，初次免疫后體液免疫應(yīng)答雖然發(fā)生早，但在加強(qiáng)免疫后三組之間無(wú)顯著性差異。研究證實(shí)eCTLA-4靶向及CpG motifs佐劑的聯(lián)合免疫策略能夠有效加快及增強(qiáng)DNA疫苗誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的體液免疫和細(xì)胞

8、免疫反應(yīng)，兩者具有協(xié)同作用。 第三部分：為了進(jìn)一步探討eCTLA4靶向效應(yīng)加快漢坦病毒DNA疫苗產(chǎn)生免疫保護(hù)的作用機(jī)制，借助體外定向誘導(dǎo)獲得了小鼠樹(shù)突狀細(xì)胞(DCs)，然后通過(guò)DCs結(jié)合實(shí)驗(yàn)(binding assay)對(duì)eCTLA4的靶向效應(yīng)進(jìn)行了初步的探討和驗(yàn)證。將pcDNA3.0/eCTLA4-S和pcDNA3.0/S質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，收獲細(xì)胞總蛋白，然后將含有eCTLA4-NP融合蛋白或NP的蛋白樣品分別在低溫環(huán)境與

9、樹(shù)突狀細(xì)胞進(jìn)行結(jié)合實(shí)驗(yàn)，經(jīng)過(guò)間接免疫熒光反應(yīng)后進(jìn)行FACS分析。研究發(fā)現(xiàn)eCTLA4-NP融合蛋白與。DCs結(jié)合效率(40％)顯著高于NP(10％)。DCs結(jié)合實(shí)驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)一步支持了eCTLA4的靶向效應(yīng)加快漢坦病毒DNA疫苗產(chǎn)生免疫保護(hù)的作用機(jī)制。 本研究以漢坦病毒滅活疫苗和DNA疫苗為研究模型，通過(guò)對(duì)漢坦病毒疫苗不同免疫方案的免疫保護(hù)效果研究、eCTLA-4和CpG motifs加速漢坦病毒DNA疫苗免疫調(diào)節(jié)作用研究以及eC

10、TLA-4對(duì)漢坦病毒DNA疫苗免疫調(diào)節(jié)作用機(jī)理的初步探討，初步闡明漢坦病毒DNA疫苗大劑量免疫以及間隔1周的快速免疫方案在加速漢坦病毒疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫保護(hù)方面具有明顯的優(yōu)勢(shì)，并通過(guò)eCTLA4靶向與CpG motifs佐劑聯(lián)合應(yīng)用策略，進(jìn)一步探討了加速漢坦病毒核酸疫苗產(chǎn)生免疫保護(hù)的策略，證實(shí)了eCTLA-4靶向/CpG motifs聯(lián)合免疫策略加快及增強(qiáng)漢坦病毒DNA疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫保護(hù)的可行性和有效性，并借助。DCs結(jié)合實(shí)驗(yàn)初步探討和