羅格列酮對(duì)ADMA氧化應(yīng)激損傷內(nèi)皮生長(zhǎng)暈細(xì)胞的影響.pdf

1、目的：觀察過(guò)氧化物體增殖劑激活的受體γ(PPARγ)激動(dòng)劑羅格列酮對(duì)非對(duì)稱性二甲基精氨酸(ADMA)氧化應(yīng)激損傷內(nèi)皮生長(zhǎng)暈細(xì)胞(EOC)的影響，并初步探討其基因?qū)W水平的機(jī)制。 方法：采用密度梯度離心法分離30ml臍血中的單個(gè)核細(xì)胞，接種至事先包被有人纖維連接蛋白的6孔培養(yǎng)板的一孔中(10cm2)。加入2ml含10％胎牛血清的EGM-2培養(yǎng)基。培養(yǎng)24h后吸除上清及懸浮細(xì)胞，貼壁細(xì)胞加2ml上述培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。此后一周內(nèi)每24h換

2、1/2原液，一周后每72h換全液并于倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。待鋪路石樣細(xì)胞生長(zhǎng)匯合后傳代，擴(kuò)增后取第二代細(xì)胞采用CD34、Flk-1、Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫組化及DiI-ac-LDL、FITC-UEA-Ⅰ雙熒光染色法鑒定培養(yǎng)細(xì)胞的內(nèi)皮屬性。 取第二代EOC按5×104/孔密度接種至24孔板中并分為五組：①對(duì)照組：以10μmol/LADMA與EOC共育72h；②羅格列酮1μmol/L組(簡(jiǎn)稱為1μmol/L組，下同)：以10

3、μmol/LADMA+1μmol/L羅格列酮與EOC共育72h；③5μmol/L組：以10μmol/LADMA+5μmol/L羅格列酮與EOC共育72h；④10μmol/L組：以10μmol/LADMA+10μmol/L羅格列酮與EOC共育72h；⑤正常組：僅加入上述藥物溶液的溶劑(含0.5％DMSO的Hanks液)與EOC共育72h。 經(jīng)上述處理后的細(xì)胞分別采用①AnnexinV-FITC和碘化丙啶(PropidiumIodi

4、de，PI)雙染色法行流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率；②MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力；③Matri-gel體外成血管試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞成血管能力；④RT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)皮一氧化氮合酶(eNOS)mRNA的表達(dá)。 結(jié)果：人臍血單個(gè)核細(xì)胞分離培養(yǎng)后7～9d出現(xiàn)散在半透明細(xì)胞，直徑約50μm。此后細(xì)胞集落在3～4d內(nèi)迅速出現(xiàn)并增大至相互匯合。倒置相差顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞呈現(xiàn)鋪路石樣排列，并具有極強(qiáng)的克隆增殖能力。 通過(guò)激光掃描共聚焦顯微鏡

5、鑒定，第二代EOC能夠攝取ac-LDL并結(jié)合UEA-Ⅰ，雙陽(yáng)性率為100％。免疫組化染色顯示第二代EOC的Ⅷ因子相關(guān)抗原、CD34、Flk-1表達(dá)陽(yáng)性率均為100％。 EOC與10μmol/LADMA共育72h后細(xì)胞的增殖能力、成血管能力均較正常組減弱，分別為0.27±0.02vs0.31±0.02(P＜0.05)和8.25±0.96vs16.25±1.71(P＜0.01)；且細(xì)胞凋亡率升高(4.03±0.05vs1.00±0.

6、00，P＜0.01)。而低濃度羅格列酮(＜10μmol/L)對(duì)ADMA所致的EOC氧化應(yīng)激損傷有不同程度的保護(hù)作用：1μmol/L羅格列酮組細(xì)胞增殖及成血管能力與對(duì)照組相比分別為0.35±0.02vs0.27±0.02(P＜0.01)和11.00±0.82vs8.25±0.96(P＜0.01)，5μmol/L組為0.38±0.03vs0.27±0.02(P＜0.01)和13.00±2.31vs8.25±0.96(P＜0.01)；細(xì)胞凋亡

7、率1μmol/L及5μmol/L組較對(duì)照組降低，分別為2.64±0.06vs4.03±0.05(P＜0.01)及1.63±0.04vs4.03±0.05(P＜0.01)。但10μmol/L羅格列酮對(duì)EOC的保護(hù)作用減弱：細(xì)胞凋亡率較5μmol/L組增加(2.72±0.19vs1.63±0.04，P＜0.01)；細(xì)胞增殖能力與對(duì)照組無(wú)明顯差異(0.27±0.05vs0.27±0.02，P＞0.05)；成血管能力反而較對(duì)照組減弱(5.00±

8、1.16vs8.25±0.96，P＜0.01)。 通過(guò)rt-PCR對(duì)各組細(xì)胞eNOS表達(dá)情況的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)1μmol/L組及正常組eNOSmRNA表達(dá)與對(duì)照組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(分別為0.23+0.02vs0.19±0.02，0.21±0.01vs0.19±0.02，P＞0.05)，5μmol/L組較對(duì)照組增強(qiáng)(0.33±0.02vs0.19±0.02，P＜0.01)而10μmol/L較對(duì)照組減弱(0.08±0.01vs0.19

9、±0.02，P＜0.01)。 結(jié)論：用貼壁培養(yǎng)法可以在體外成功培養(yǎng)獲得人臍血EOC。通過(guò)熒光細(xì)胞化學(xué)染色及免疫組化染色可以證實(shí)培養(yǎng)細(xì)胞具有內(nèi)皮特性。 高濃度ADMA對(duì)EOC的增殖及成血管能力都有損傷，并增加細(xì)胞的凋亡率。而低濃度(＜10μmol/L)羅格列酮對(duì)ADMA所致的氧化應(yīng)激損傷有不同程度的保護(hù)作用。但10μmol/L羅格列酮的保護(hù)作用反而減弱甚至抑NEOC成血管。 這種保護(hù)作用部分是通過(guò)提高EOC的eNO