NFAT1在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及意義研究.pdf

1、前言
　　研究表明，活化T細(xì)胞核因子(thenuclearfactorofactivatedTcells,NFAT)家族成員在許多人類(lèi)惡性病變中具有腫瘤轉(zhuǎn)型功能。NFAT1是該家族的一個(gè)重要成員，其活化既能夠誘導(dǎo)T細(xì)胞的活化和增殖，又能夠通過(guò)上調(diào)FasL表達(dá)，在成熟T細(xì)胞中引起“活化誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡”(activation-inducedcelldeath，AICD)。據(jù)報(bào)道，NFAT1和眾多腫瘤細(xì)胞的存活、凋亡、遷移及侵襲相關(guān)，而

2、NFAT1在膠質(zhì)瘤中的研究尚屬空白。我們以往實(shí)驗(yàn)顯示，在多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)中，白介素-13受體α2亞單位的表達(dá)增高受NFAT1調(diào)控，因此我們推測(cè)，NFAT1可能在GBM中表達(dá)上調(diào)并且活化。如同在T細(xì)胞和其他腫瘤中，在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，NFAT1也可能調(diào)節(jié)增殖及侵襲。而影響NFAT1活性的藥物可能對(duì)膠質(zhì)瘤產(chǎn)生影響。此外，由于NFAT1與免疫系統(tǒng)聯(lián)系緊密，對(duì)NFAT1的研究可能成為連接膠質(zhì)瘤化療和免疫治療的紐帶。本研究旨在探討NFAT

3、1在不同級(jí)別膠質(zhì)瘤中的表達(dá)情況和作用，以及相關(guān)的分子機(jī)制。
　　材料和方法
　　1、mRNA芯片分析
　　利用中國(guó)腦膠質(zhì)瘤基因組圖譜計(jì)劃111例臨床膠質(zhì)瘤標(biāo)本mRNA表達(dá)Microarray數(shù)據(jù)庫(kù)，運(yùn)用聚類(lèi)分析法，考察NFAT1在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)情況。運(yùn)用聚類(lèi)分析和Pearson相關(guān)分析，考察NFAT1mRNA表達(dá)與侵襲相關(guān)基因表達(dá)、Fas表達(dá)的關(guān)系。
　　2、RT-PCR
　　通過(guò)RT-PCR進(jìn)一步驗(yàn)證NF

4、AT1在24例GBM及GBMU87、U251細(xì)胞系中的表達(dá)。通過(guò)RT-PCR考察NFAT1基因敲除對(duì)侵襲相關(guān)基因表達(dá)的影響。
　　3、免疫組織化學(xué)染色及免疫熒光染色
　　通過(guò)免疫組織化學(xué)染色法，在50例膠質(zhì)瘤（25例GBM和25例星形細(xì)胞瘤）中考察NFAT1的表達(dá)和細(xì)胞內(nèi)定位情況。通過(guò)免疫熒光染色，在U87細(xì)胞中，考察NFAT1的表達(dá)和活性，以及環(huán)孢素(CsA)、FK506、PMA和離子霉素對(duì)NFAT1活性的影響。
　

5、　4、NFAT1基因沉默
　　運(yùn)用shRNA轉(zhuǎn)染技術(shù)，在U87、U251細(xì)胞中穩(wěn)定敲除NFAT1表達(dá)。通過(guò)RT-PCR及westernblot檢測(cè)基因沉默效果。
　　5、細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)
　　通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，明確NFAT1基因沉默對(duì)細(xì)胞增殖的影響，以及CsA、FK506、PMA和離子霉素對(duì)GBM細(xì)胞增殖的影響。
　　6、體外侵襲實(shí)驗(yàn)
　　通過(guò)TranswellMatrigel實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)

6、胞侵襲力。明確NFAT1基因沉默對(duì)細(xì)胞侵襲力的影響，以及CsA和FK506對(duì)GBM細(xì)胞侵襲力的影響。
　　7、碘化丙啶染色流式細(xì)胞儀
　　通過(guò)碘化丙啶(PI)染色流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期、細(xì)胞死亡情況。明確NFAT1基因沉默以及PMA和離子霉素對(duì)GBM細(xì)胞周期、細(xì)胞死亡的影響。
　　8、透射電鏡
　　通過(guò)透射電鏡形態(tài)學(xué)觀察，檢測(cè)PMA和離子霉素對(duì)GBM細(xì)胞、染色質(zhì)、細(xì)胞核形態(tài)的影響。定性分析PMA和離子霉素對(duì)GBM

7、細(xì)胞凋亡的影響。
　　9、TUNEL實(shí)驗(yàn)
　　運(yùn)用TUNEL實(shí)驗(yàn)定量分析NFAT1基因沉默以及PMA和離子霉素對(duì)GBM細(xì)胞凋亡的影響。
　　10、Real-timePCR和Westernblot
　　運(yùn)用real-timePCR和westernblot檢測(cè)NFAT1基因沉默以及PMA和離子霉素對(duì)GBM細(xì)胞Fas/FasL表達(dá)的影響。
　　11、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　芯片分析獲得的mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)用于聚類(lèi)分析

8、和Pearson相關(guān)分析。聚類(lèi)分析采用averagelinkage層次聚類(lèi)法，聚類(lèi)分析結(jié)果用TreeView軟件顯示?？ǚ綑z驗(yàn)及t檢驗(yàn)用于檢測(cè)差異顯著性。所有數(shù)據(jù)由至少三次實(shí)驗(yàn)得到的均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。雙尾P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果
　　1、NFAT1在GBM臨床標(biāo)本和細(xì)胞系中高表達(dá)
　　mRNA芯片分析顯示，和低級(jí)別膠質(zhì)瘤相比，NFAT1在GBM中高表達(dá)。RT-PCR進(jìn)一步證實(shí)NFAT1在GBM臨床標(biāo)本及

9、U87、U251細(xì)胞中高表達(dá)。免疫組織化學(xué)染色顯示，在星形細(xì)胞瘤中，NFAT1表達(dá)水平較低;在GBM中，NFAT1高表達(dá)，并且位于細(xì)胞核內(nèi)。
　　2、NFAT1在GBM細(xì)胞中活化且有不同的活化程度
　　免疫熒光染色顯示，NFAT1在U87、U251細(xì)胞中高表達(dá)，并且主要位于細(xì)胞核內(nèi)，處于活化狀態(tài)，而CsA和FK506能夠抑制NFAT1活性;PMA和離子霉素則能夠進(jìn)一步激活NFAT1，使其處于過(guò)度激活狀態(tài)。
　　3、NF

10、AT1活性抑制或表達(dá)下調(diào)能夠降低GBM細(xì)胞侵襲力
　　TranswellMatrigel實(shí)驗(yàn)顯示，藥物抑制NFAT1活性，或者特異性敲除NFAT1表達(dá)，能夠明顯降低U87細(xì)胞的侵襲力。
　　4、NFAT1活性抑制或表達(dá)下調(diào)對(duì)GBM細(xì)胞增殖無(wú)明顯影響
　　MTT實(shí)驗(yàn)證實(shí)，藥物抑制NFAT1活性，或者特異性敲除NFAT1表達(dá)對(duì)U87細(xì)胞增殖無(wú)明顯影響。PI染色流式細(xì)胞顯示NFAT1基因沉默對(duì)U87細(xì)胞周期無(wú)明顯影響。

11、>　　5、在GBM中NFAT1表達(dá)和Cox-2，MMP-7，MMP-9表達(dá)相關(guān)
　　利用111例膠質(zhì)瘤mRNAmicroarray數(shù)據(jù)，采用聚類(lèi)分析及Pearson相關(guān)分析，我們發(fā)現(xiàn)，在膠質(zhì)瘤中NFAT1表達(dá)與侵襲相關(guān)基因Cox-2、MMP-7、MMP-9表達(dá)明顯相關(guān)。RT-PCR證實(shí)，NFAT1基因敲除明顯抑制Cox-2、MMP-7、MMP-9表達(dá)。
　　6、PMA和離子霉素抑制GBM細(xì)胞增殖
　　MTT實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞計(jì)

12、數(shù)顯示，加入PMA和/或離子霉素后，U87及U251細(xì)胞增殖顯著降低（P＜0.05）。
　　7、PMA和離子霉素誘導(dǎo)GBM細(xì)胞凋亡
　　透射電鏡形態(tài)學(xué)觀察顯示，加入PMA和離子霉素后，GBM細(xì)胞出現(xiàn)明顯的凋亡形態(tài)學(xué)特征;TUNEL實(shí)驗(yàn)證實(shí)，加入PMA和/或離子霉素后，GBM細(xì)胞凋亡明顯增多。
　　8、PMA和離子霉素誘導(dǎo)GBM細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞死亡
　　PI染色流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，加入PMA和離子霉素后，GBM細(xì)

13、胞出現(xiàn)明顯的G0/G1期細(xì)胞周期阻滯，sub-G0期成分增多。
　　9、在膠質(zhì)瘤中NFAT1表達(dá)和Fas表達(dá)相關(guān)
　　利用111例膠質(zhì)瘤mRNAmicroarray數(shù)據(jù)，采用聚類(lèi)分析及Pearson相關(guān)分析，我們發(fā)現(xiàn)，在膠質(zhì)瘤中NFAT1表達(dá)與Fas表達(dá)明顯相關(guān)。
　　10、下調(diào)NFAT1表達(dá)阻礙PMA和離子霉素誘導(dǎo)GBM細(xì)胞死亡
　　MTT實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞計(jì)數(shù)顯示，NFAT1基因沉默降低PMA和離子霉素對(duì)GBM細(xì)胞增

14、殖的抑制作用;TUNEL實(shí)驗(yàn)證實(shí)，NFAT1基因沉默抑制PMA和離子霉素誘導(dǎo)的GBM細(xì)胞凋亡;PI染色流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，NFAT1基因沉默抑制PMA和離子霉素誘導(dǎo)的GBM細(xì)胞周期阻滯及細(xì)胞死亡。
　　11、PMA和離子霉素通過(guò)NFAT1上調(diào)FasL表達(dá)
　　Real-timePCR和westernblot顯示，在GBM細(xì)胞中，PMA和離子霉素明顯上調(diào)Fas/FasL表達(dá);而NFAT1基因沉默明顯抑制PMA和離子霉素誘導(dǎo)的F

15、asL表達(dá)。
　　12、中和FasL抑制PMA和離子霉素誘導(dǎo)的GBM細(xì)胞凋亡
　　TUNEL實(shí)驗(yàn)顯示，使用特異性抗體中和FasL明顯抑制PMA和離子霉素誘導(dǎo)的GBM細(xì)胞凋亡。
　　結(jié)論
　　1.NFAT1在GBM細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)。
　　2.在GBM細(xì)胞中，NFAT1具有不同的活化程度，普通活化和過(guò)度激活。
　　3.普通活化時(shí)，NFAT1能夠調(diào)節(jié)GBM細(xì)胞的侵襲性。
　　4.當(dāng)NFAT1被PMA和/