FrzA基因靶向轉(zhuǎn)導(dǎo)干預(yù)心肌細(xì)胞氧化損傷模型對于防治心力衰竭的研究.pdf

1、目的：以重組9型腺相關(guān)病毒（recombinant adeno-associated virus serotyoe9,rAAV9）為載體介導(dǎo) FrzA基因轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞氧化損傷模型，觀察是否能抑制心肌細(xì)胞Wnt通路表達活性，進而減輕心肌細(xì)胞凋亡，促進細(xì)胞存活。
　　方法：分離培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞，免疫熒光法對心肌細(xì)胞進行鑒定。利用H2O2刺激心肌細(xì)胞建立心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型，模擬體內(nèi)心力衰竭狀態(tài)，MTT法檢測細(xì)胞活性及Annexin

2、V-FITC/PI雙染法檢測心肌細(xì)胞凋亡率，確定 H2O2最佳濃度。用啟動子為CMV的rAAV9載體攜帶目的基因轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞，流式細(xì)胞儀及Western blot測定細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率，確定rAAV9的最佳轉(zhuǎn)染效率。rAAV9介導(dǎo)FrzA基因轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞，Western blot檢測各組細(xì)胞Wnt通路關(guān)鍵分子蛋白的表達，RT-PCR檢測各組細(xì)胞Wnt通路關(guān)鍵分子 mRNA的表達。Western blot檢測各組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達，Ann

3、exinV-FITC/PI雙染法檢測各組心肌細(xì)胞凋亡率的變化。
　　結(jié)果：（1）免疫熒光結(jié)果顯示心肌細(xì)胞的純度可達到98％以上。（2）MTT與AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)果顯示H2O2濃度對心肌細(xì)胞活性的影響是以劑量依賴的方式，隨著H2O2的濃度增加，心肌細(xì)胞活性降低，細(xì)胞凋亡率增高，應(yīng)選擇濃度100μM的H2O2來建立心肌細(xì)胞氧化損傷模型。（3）Western blot結(jié)果均顯示rAAV9-CMV-eGFP可特異性轉(zhuǎn)

4、染心肌細(xì)胞，eGFP的表達高峰在第5天。流式結(jié)果顯示 rAAV9-CMV-eGFP-FrzA、rAAV9-CMV-eGFP轉(zhuǎn)染效率無差異。（4）Western blot及RT-PCR結(jié)果均顯示H2O2可有效激活Wnt信號通路，且FrzA基因轉(zhuǎn)染可抑制Wnt信號通路的活性。（5）Western blot及AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)果顯示，H2O2激活Wnt信號通路后，細(xì)胞凋亡增多。而rAAV9介導(dǎo)FrzA基因轉(zhuǎn)導(dǎo)可有效減輕H