截肢后大鼠肝腎損傷及其防護(hù)機(jī)制的研究.pdf

1、背景與目的：當(dāng)機(jī)體受到創(chuàng)(燒)傷、手術(shù)、休克等打擊時(shí)，會(huì)產(chǎn)生一系列防御反應(yīng)，由于創(chuàng)傷本身及機(jī)體的過度性防御可能造成全身性的損傷，以心、腦、腎、肝等重要遠(yuǎn)隔臟器的損傷較重。腎臟為人體重要的排泄毒素、調(diào)節(jié)水電解質(zhì)平衡及內(nèi)分泌器官，肝臟為人體重要的合成和代謝器官，在應(yīng)激條件下，均易受到損傷。臨床上一旦出現(xiàn)急性腎功能衰竭，死亡率極高，但因其病理生理機(jī)制至今未明，早期診斷并采取有效的預(yù)防措施較為困難，而急性肝損害在嚴(yán)重創(chuàng)傷后也可出現(xiàn)，其機(jī)制也不明

2、確。目前人們已逐漸認(rèn)識(shí)到創(chuàng)傷是一種系統(tǒng)性疾病，從心臟手術(shù)、嚴(yán)重?zé)齻葎?dòng)物模型和臨床實(shí)驗(yàn)中，研究創(chuàng)傷后的遠(yuǎn)隔臟器的損傷；從血流動(dòng)力學(xué)的改變、炎癥反應(yīng)、過氧化作用等方面研究其發(fā)生機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)旨在建立截肢創(chuàng)傷模型來研究肝腎早期損傷的發(fā)生機(jī)制和防治措施，因而建立了截肢創(chuàng)傷后大鼠腎臟、肝臟的損傷模型，觀察截肢后炎癥、免疫、氧化因子等因素及病理學(xué)變化，并引入新型生物學(xué)指標(biāo)：腎損傷分子-1檢驗(yàn)其在該模型中對(duì)于急性腎損傷的預(yù)警作用。同時(shí)設(shè)立硫化氫(H2

3、S)供體硫氫化鈉(NaHS)、胱硫醚Y-裂解酶(CSE)抑制劑炔丙基甘氨酸(PPG)、免疫抑制劑他克莫司(Tacrolimus，F(xiàn)K-506)、醛固酮(ALD)抑制劑螺內(nèi)酯干預(yù)組，進(jìn)一步研究以上途徑在截肢后肝腎損傷中的作用及其機(jī)制，以期為早期發(fā)現(xiàn)、診斷及有效干預(yù)創(chuàng)傷后肝腎損傷提供新方法和新措施。本實(shí)驗(yàn)分為兩大部分：一、研究截肢后急性肝腎損傷發(fā)生的病理生理機(jī)制、早期預(yù)警指標(biāo)及NaHS、PPG、FK506、螺內(nèi)酯干預(yù)在急性肝腎損傷過程中的作

4、用及其作用機(jī)制；二、研究創(chuàng)傷后肝腎線粒體的功能變化及NaHS、PPG、FK506、螺內(nèi)酯的干預(yù)效果。
　　 方法：本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用大鼠左后肢截肢模型。第一部分實(shí)驗(yàn)分組：雄性Wistar大鼠91只，隨機(jī)分為13組。正常對(duì)照組、手術(shù)后1h組、2h、4h、6h、12h、24h、48h、72h組及NaHS、PPG、FK-506、螺內(nèi)酯干預(yù)組。干預(yù)組大鼠均在術(shù)后6小時(shí)處死(處死時(shí)間點(diǎn)由預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)論得來)。每組7只。
　　 觀察各組大鼠肝腎

5、組織病理改變及血漿硫化氫(H2S)、髓過氧化物酶(MPO)、丙二醛(MDA)、血管緊張素II(AngII)、醛固酮(ALD)、一氧化氮(NO)、白介素-6(IL-6)、腎損傷分子-1(KIM-1)及肌酐(Cr)、尿素(Ur)水平的變化，同時(shí)檢測(cè)各組大鼠腎組織腎損傷分子-1(KIM-1)、肝腎組織胱硫醚γ-裂解酶(CSE)活性、髓過氧化物酶(MPO)、丙二醛(MDA)、醛固酮(ALD)的含量及鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(CnA-α)基因的表達(dá)。

6、>　　 第二部分實(shí)驗(yàn)分組：雄性SD大鼠48只，分為：正常對(duì)照組、截肢后6h組、干預(yù)組(分為4組：分別給予NaHS、PPG、FK-506、螺內(nèi)酯干預(yù)，截肢后6h處死)，每組8只。檢測(cè)肝腎組織線粒體呼吸控制率(RCR)、膜電位、ATP酶活性的變化。
　　 結(jié)果：與正常對(duì)照組比較，截肢術(shù)后肝腎臟器出現(xiàn)不同程度組織充血水腫、細(xì)胞腫脹，截肢術(shù)后6h損傷最重，同時(shí)伴有血漿Cr、ALT、AST的下降。血漿及腎組織KIM-1在正常組合量極低，

7、截肢后1小時(shí)呈持續(xù)升高，并明顯早于血Cr的升高。截肢后大鼠血漿MPO、MDA、IL-6、AngII濃度呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，血漿H2S、NO濃度在截肢后下降。肝腎組織中MPO、MDA含量在截肢后出現(xiàn)升高與血漿基本相似，而CSE活性下降近似于血漿H2S濃度變化。血漿及腎組織ALD水平呈現(xiàn)雙峰樣改變，在截肢后1h即升高，隨后降低，截肢后6h達(dá)最低值，然后開始升高。CAn-α基因的表達(dá)在截肢后肝腎組織中均呈現(xiàn)升高趨勢(shì)。
　　 與截肢后6h比較

8、，NaHS干預(yù)后血漿Cr、NO、ALD、AngII、MPO、H2S顯著升高，血漿Ur、ALT，AST無明顯變化，血漿MDA、KIM-1、IL-6顯著降低。腎組織病理性損傷減輕，且MDA、MPO、KIM-1水平也顯著降低，而CSE活性、ALD含量、CaN基因的表達(dá)顯著升高。肝組織病理性損傷減輕，且MDA、MPO水平也顯著降低，而CSE活性、CaN基因的表達(dá)顯著升高。
　　 PPG干預(yù)后各項(xiàng)指標(biāo)的變化：血漿ALT、AST、NO、AL

9、D、AngII、MPO、H2S、IL-6水平顯著降低，而血漿Ur、MDA無明顯變化。血漿Cr、KIM-1顯著升高。腎組織病理性損傷略有加重，且MPO無顯著變化，MDA含量、CaN基因的表達(dá)、KIM-1也顯著升高，而CSE活性、ALD濃度顯著降低。肝組織病理性損傷無明顯加重，MDA、MPO水平無顯著變化，CaN基因的表達(dá)顯著升高，而CSE活性、顯著降低。
　　 螺內(nèi)酯干預(yù)后各項(xiàng)指標(biāo)的變化：血漿ALD、AngII、MDA、MPO、I

10、L-6顯著降低，而血漿Cr、Ur、MDA無明顯變化，血漿ALT、AST、NO、H2S、KIM-1顯著升高。腎組織損傷有所減輕，但MDA無顯著變化，CSE活性、ALD、KIM-1含量顯著升高，而MPO、CaN基因的表達(dá)顯著降低。肝組織充血、水腫及細(xì)胞損傷減輕，但CSE活性無顯著變化，而MPO、MDA、CaN基因的表達(dá)顯著降低。
　　 FK506干預(yù)后各組指標(biāo)變化：血漿Cr、MDA、MPO、KIM-1、IL-6顯著下降，而血漿Ur無

11、明顯變化，血漿ALT、AST、NO、ALD、AngII、H2S顯著升高。腎組織病理性損傷減輕，且MDA、MPO、KIM-1水平及CaN基因的表達(dá)也顯著降低，而CSE活性、ALD濃度顯著升高。肝組織病理性損傷也有減輕，且MDA、MPO水平及CaN基因的表達(dá)也顯著降低，CSE活性顯著升高。
　　 截肢后大鼠肝腎組織線粒體呼吸控制率、膜電位、ATP酶活性均明顯下降，給予NaHS、FK-506、螺內(nèi)酯干預(yù)后有不同程度回升，PPG干預(yù)后以

12、上指標(biāo)出現(xiàn)不同程度升高或無明顯變化。
　　 結(jié)論：截肢術(shù)可造成大鼠的急性肝腎損傷。腎損傷分子-1為較敏感、可靠的判斷截肢術(shù)后急性腎損傷的生物學(xué)指標(biāo)，可起到早期預(yù)警的作用。H2S/CSE體系參與了截肢術(shù)后肝腎臟器的損傷過程，NaHS可對(duì)損傷的肝腎組織起保護(hù)作用，PPG的應(yīng)用可能進(jìn)一步加重組織損傷。CaN與截肢后肝腎的損傷過程密切相關(guān)，使用FK506干預(yù)可對(duì)截肢后損傷的腎組織具有保護(hù)作用。ALD參與截肢創(chuàng)傷后肝腎急性損傷過程，螺內(nèi)酯