羅漢果刺激性單性結(jié)實(shí)果實(shí)的生物學(xué)特性研究.pdf

1、羅漢果Siratia grosvenorii是藥食同源的傳統(tǒng)中藥，是僅分布于廣西北部山區(qū)的中國(guó)特有藥用植物。羅漢果及其甜苷V應(yīng)用前景廣闊，需求量不斷增加，然而適栽區(qū)域狹窄且無(wú)法連茬及種植雄株浪費(fèi)了大量的土地將造成未來(lái)土地的稀缺、人工授粉的繁重及勞動(dòng)力資源的緊缺、有籽果實(shí)對(duì)甜苷V的提取和利用造成很大的困難等原因使甜苷V資源的匱乏限制了該產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。目前選育出的三倍體無(wú)籽羅漢果雖然解決了種子的難題，但果實(shí)變小，且仍需人工授粉，種植收益遠(yuǎn)低于

2、有籽品種，無(wú)法推廣種植。本課題利用生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑刺激羅漢果雌花獲得單性結(jié)實(shí)羅漢果的技術(shù)，較好地解決了生產(chǎn)上雄株栽種占地面積廣、人工授粉等問(wèn)題，提高了羅漢果的產(chǎn)量，生產(chǎn)加工成本和難度均大幅度地降低。這是羅漢果栽培上的有益發(fā)現(xiàn)，它的應(yīng)用將改變羅漢果傳統(tǒng)種植中必須人工授粉才能結(jié)果的栽培模式，結(jié)束繁重的人工授粉時(shí)代。本文對(duì)刺激性單性結(jié)實(shí)的羅漢果果實(shí)的生物學(xué)和解剖學(xué)特征、內(nèi)源激素變化及基因表達(dá)譜等方面進(jìn)行了研究，為羅漢果的刺激性單性結(jié)實(shí)果實(shí)的形成機(jī)理

3、奠定基礎(chǔ)。研究結(jié)果敘述如下:
　　1.刺激性單性結(jié)實(shí)的羅漢果果實(shí)的發(fā)育規(guī)律為:單性結(jié)實(shí)果實(shí)的生長(zhǎng)發(fā)育與正常授粉果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育一致，果實(shí)快速生長(zhǎng)期為3-20 d，30 d果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育變緩，成熟果為中果到大果，果實(shí)少籽，甜苷V含量平均為1.47％，與授粉果實(shí)無(wú)顯著差異，果肉利用率高，果肉疏松，便于干燥且不易出現(xiàn)響果，果皮較厚而硬，利于運(yùn)輸和保存。
　　2.單性結(jié)實(shí)果實(shí)的解剖學(xué)特征為:單性結(jié)實(shí)果實(shí)誘導(dǎo)后僅珠被發(fā)育形成種皮，胚不生長(zhǎng)，

4、成熟后僅具種殼，種子干癟無(wú)種仁。誘導(dǎo)后3d果肉細(xì)胞明顯膨大，較授粉果實(shí)早，且細(xì)胞較大。
　　3.單性結(jié)實(shí)果實(shí)中內(nèi)源激素的變化規(guī)律為:IAA的含量先降后升，且除10 d和20 d外單性結(jié)實(shí)果實(shí)中的I從含量均比授粉果實(shí)高。GA含量先升后降，但單性結(jié)實(shí)果實(shí)峰值均較授粉組高（1 d除外），分別在3d和5-10 d。ZT含量先降后升，10d前，單性結(jié)實(shí)果實(shí)中的ZT含量均較授粉果實(shí)高，但15 d-20 d含量較低。ABA含量先降后升，單性結(jié)實(shí)

5、果實(shí)中含量均較授粉果實(shí)高，前者較低值主要出現(xiàn)在5-20 d且30 d時(shí)迅速增加，而后者較低值維持至30 d且40 d時(shí)才迅速增加。
　　4.應(yīng)用Solexa高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)果實(shí)發(fā)育初期（0d-3d）進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序得到352，757，748條reads，通過(guò)組裝，最終得到69047條unigene。在轉(zhuǎn)錄組中發(fā)現(xiàn)與單性結(jié)實(shí)果實(shí)發(fā)育初期相關(guān)的激素代謝相關(guān)的unigene共716條，其中涉及生長(zhǎng)素的有204條、涉及赤霉素的有

6、67條、涉及細(xì)胞分裂素的有177條、涉及油菜素內(nèi)酯的有140條、涉及乙烯的有128條。另外，我們還發(fā)現(xiàn)了Cytochrome P450基因unigene121條，涉及脫落酸的unigene81條，涉及水楊酸的unigene78條，涉及茉莉酸甲酯的unigene87條。此外，我們還發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)錄因子的unigene共406條，包括了MYBtranscription factor、MYC、RAX1、WRKY、HB29、HBP-1b、BZIP、G

7、ATA、NAC、B3 domain-containing transcription factor、bHLH等，這些結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因的unigene是今后對(duì)誘導(dǎo)單性結(jié)實(shí)進(jìn)行進(jìn)一步研究的重要基因資源。
　　5.單性結(jié)實(shí)羅漢果果實(shí)發(fā)育初期相關(guān)基因的篩選:通過(guò)對(duì)單性結(jié)實(shí)果實(shí)發(fā)育初期的轉(zhuǎn)錄組的差異分析，以0d樣品為對(duì)照發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)1d后1831個(gè)基因上調(diào)并有2768個(gè)基因下調(diào)，誘導(dǎo)3d后有2776個(gè)上調(diào)并有2299個(gè)下調(diào)。經(jīng)過(guò)對(duì)差異基因及果

8、實(shí)生長(zhǎng)的分析，我們找到了與誘導(dǎo)單性結(jié)實(shí)發(fā)育初期相關(guān)的基因共26個(gè)，為以后的全長(zhǎng)基因克隆和功能驗(yàn)證指明了方向。
　　6.qRT-PCR實(shí)驗(yàn)對(duì)這26個(gè)基因進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明:基因的相對(duì)表達(dá)量的表達(dá)變化模式與轉(zhuǎn)錄組里的表達(dá)模式總體上是接近的，并揭示了AUX/IAA14蛋白、GA20ox氧化酶、IPT及CYP735A合成酶、ACO合成酶、CYP85A1合成酶、細(xì)胞周期蛋白cyclin-D5-1、BAK1、BRI1及BSK調(diào)節(jié)因子及CHS合