羅漢果水提物和羅漢果苷Ⅴ治療非酒精性脂肪肝炎的藥效和機(jī)制研究.pdf

1、目的：研究羅漢果水提物和羅漢果苷Ⅴ對非酒精性脂肪肝病炎(NASH)的肝脂質(zhì)、轉(zhuǎn)氨酶、肝系數(shù)、信號通路及脂肪酸合成相關(guān)基因表達(dá)的影響，探究羅漢果對NASH的藥理作用及作用機(jī)理，為NASH的治療提供新的思路和方法。
　　方法：實(shí)驗(yàn)分為體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和體外實(shí)驗(yàn)。
　　體內(nèi)實(shí)驗(yàn)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)通過建立非酒精性脂肪肝炎的C57BL/6小鼠模型，將C57BL/6雄性小鼠隨機(jī)分為等熱量空白對照組(MCS)、模型組（MCD）、羅漢果水提物低劑量組(Low

2、)、羅漢果水提物中劑量組(Medium)、羅漢果水提物高劑量組(High)、非諾貝特陽性組(Positive)六組。MCS組飼喂等熱量的正常飼料，其余各組飼喂蛋氨酸膽堿缺乏（MCD）飼料的同時(shí)，低、中、高劑量組小鼠分別灌胃給50mg/Kg/day、100mg/Kg/day、200mg/Kg/day，Positive組使用陽性藥物非諾貝特100mg/kg/day灌胃，各組小鼠飼養(yǎng)并灌胃兩周后，收集小鼠腸道糞便樣品，摘取眼球采血，處死小鼠，

3、取小鼠肝臟組織。糞便用于檢測 NASH模型小鼠腸道菌的改變。血液樣品用于檢物丙二醛(MDA)、總膽固醇(CHO)含量、組織病理學(xué)以及相關(guān)信號通路蛋白和脂肪合成及炎癥相關(guān)基因的表達(dá)。
　　體外實(shí)驗(yàn)用小鼠正常肝細(xì)胞系A(chǔ)ML-12細(xì)胞建立蛋氨酸-膽堿缺乏（MCD）模型。分別用羅漢果水提物和羅漢果苷Ⅴ作用于MCD細(xì)胞模型，檢測其對NASH的藥效。檢測AML-12細(xì)胞的藥效生化指標(biāo)TG，MDA，SOD，然后檢測ER、NF-κB、MAPK信號

4、通路蛋白以及脂肪合成相關(guān)因子和炎癥相關(guān)因子的基因表達(dá)。
　　結(jié)果：動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組相比，羅漢果水提物無明顯肝毒性，而服用陽性藥非諾貝特小鼠組肝系數(shù)顯著增高（P＜0.01），說明其會對肝臟造成損傷。小鼠肝臟病理切片HE染色觀察發(fā)現(xiàn)MCD可誘導(dǎo)小鼠肝臟明顯脂肪變性和炎性浸潤，而羅漢果水提物干預(yù)可減少肝臟脂質(zhì)堆積以及炎性浸潤的現(xiàn)象。腸道菌檢測結(jié)果顯示，羅漢果水提物干預(yù)后的小鼠NASH模型，擬桿菌門對厚壁菌門的比值與MCD模型組

5、相比有較為明顯的增高作用，且羅漢果水提物濃度越高越接近于對照組的比值。與對照組相比，模型組Akkermansia muciniphilia菌屬顯著降低，而羅漢果水提物處理組可使疣微菌門的Akkermansia muciniphilia菌屬劑量依賴性顯著增加。與模型組相比，中、高濃度羅漢果水提物均能顯著性降低血清中AST、ALT含量；高、中、低劑量羅漢果水提物劑量依賴性地降低肝臟TG、MDA含量，對CHO無影響。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路蛋白BI

6、P、p-PERK、IRE-1、ATF-6、SREBP-1在模型組中表達(dá)上調(diào)，羅漢果水提物作用后下調(diào)其表達(dá)；MAPK信號通路蛋白p-JNK, p-p38,在模型組中表達(dá)上調(diào)，JNK,p38表達(dá)不變，羅漢果水提物作用后 p-JNK, p-p38，表達(dá)下調(diào)，JNK,p38表達(dá)不變；NF-κB信號通路中模型組IKKα、IKKβ、胞漿p-p65和核內(nèi)p-p65表達(dá)上調(diào)，IκBα表達(dá)下調(diào)，p65不變，羅漢果水提物作用后IKKα、IKKβ、胞漿p-p

7、6和核內(nèi)p-p65表達(dá)下調(diào)，IκBα表達(dá)上調(diào)，p65表達(dá)不變。在模型組脂肪酸合成相關(guān)基因FAS、SCD1、GPAT、ACC和炎癥相關(guān)基因TNF-α，IL-1β，IL-6表達(dá)上調(diào)，羅漢果水提物作用后下調(diào)這些基因的表達(dá)。體外實(shí)驗(yàn)成功建立AML-12細(xì)胞MCD模型，結(jié)果表明，與模型組相比，羅漢果水提物和羅漢果苷Ⅴ顯著降低肝細(xì)胞脂質(zhì)堆積和脂質(zhì)過氧化。羅漢果水提物和羅漢果苷Ⅴ對肝細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、NF-κB、MAPK信號通路蛋白和脂肪酸合成及炎癥

8、相關(guān)基因的影響趨勢與體內(nèi)動物模型相同。
　　結(jié)論：羅漢果水提物和羅漢果苷Ⅴ對體內(nèi)動物 NASH模型和體外細(xì)胞 NASH模型具有治療效果，能降脂降酶、逆轉(zhuǎn)肝臟脂肪積累和減輕脂質(zhì)過氧化；羅漢果水提物和羅漢果苷Ⅴ能降低ER、NF-κB、MAPK通路中蛋白的表達(dá)，同時(shí)抑制脂肪酸合成基因ACC、FAS、SCD1、GPAT和炎癥相關(guān)基因TNF-α、IL-1β、IL-6的表達(dá)；總之，羅漢果水提物和羅漢果苷Ⅴ能減輕肝臟脂質(zhì)的堆積，改善炎癥反應(yīng)，有