重組EV71、CA16型手足口病雙價VLP疫苗的初步研究.pdf

1、目的:運用Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)構(gòu)建并表達重組EV71、CA16病毒樣顆粒（Virus-like particle，VLP），對重組EV71、CA16雙價VLP疫苗的免疫原性及免疫保護性進行評價，為發(fā)展安全、有效、具有保護作用的手足口病新型疫苗奠定基礎(chǔ)。
　　方法:（1）通過測序分別獲得構(gòu)建EV71、CA16 VLP所必需的疫苗候選株基因P1、3CD片段序列，首先根據(jù)昆蟲密碼子偏愛性選擇優(yōu)勢密碼子，運用分子生物學(xué)技術(shù)

2、對EV71、CA16 P1和3CD基因進行設(shè)計和全基因合成。將合成后的P1、3CD序列構(gòu)建到穿梭質(zhì)粒pFastBacDual上，通過位點特異性重組篩選陽性重組菌DH10BacTM E.coli，將EV71、CA16的重組桿粒Bacmid轉(zhuǎn)染昆蟲細胞Sf9獲得重組桿狀病毒；通過透射電鏡、間接免疫熒光、SDS-PAGE、Western blot對純化的重組EV71、CA16 VLP蛋白抗原進行鑒定。（2）將純化后的重組目的蛋白，聯(lián)合使用Al

3、(OH)3佐劑，采用腹腔注射的途徑免疫4-6周齡ICR小鼠，于0d、14d對小鼠進行兩次免疫，一免10d和二免10d后采集小鼠尾靜脈血，二免14d后取小鼠脾臟。通過間接ELISA法檢測血清 IgG抗體效價、血清抗體亞型分布及ELISPOT等方法比較重組 EV71、CA16單價及雙價VLP疫苗免疫原性；通過體外微量中和試驗比較重組EV71、CA16單價及雙價VLP疫苗對現(xiàn)有EV71、CA16流行株的保護作用；將EV71、CA16單價及雙價

4、VLP疫苗免疫 ICR乳母鼠，用EV71、CA16強毒株攻擊其新生5日齡乳鼠，觀察乳鼠體重變化及存活率，綜合比較重組EV71、CA16單價及雙價 VLP疫苗的免疫保護效果。
　　結(jié)果:（1）經(jīng)SDS-PAGE、Western blot以及間接免疫熒光試驗結(jié)果均證明了EV71、CA16 VLP的表達，透射電鏡觀察可見直徑大小約為23～30nm的EV71、CA16 VLP，與完整的病毒顆粒結(jié)構(gòu)一致，通過蔗糖密度梯度離心純化，獲得了純度

5、在90％以上的EV71、CA16 VLP抗原；（2）動物實驗比較重組EV71、CA16 VLP單價、雙價疫苗的免疫原性。間接ELISA法顯示重組EV71、CA16單價、雙價 VLP疫苗組與PBS對照組抗體水平差異顯著（p<0.05），且雙價組顯著高于單價組（p<0.05）。中和抗體效價測定顯示雙價組中和抗體效價高于單價組（p<0.05）。小鼠脾淋巴細胞中IFN-γ和IL-4分泌細胞水平檢測顯示重組EV71、CA16 VLP疫苗各組均可以

6、檢測到一定水平的IFN-γ和相對較低水平的IL-4，且雙價疫苗組高于單價組。應(yīng)用 EV71-BJ、CA16-TS強毒株分別攻毒，證實重組EV71、CA16單價、雙價VLP疫苗均能有效保護5日齡ICR乳鼠抵抗致死劑量病毒的攻擊，且雙價VLP疫苗保護效果優(yōu)于單價VLP疫苗。
　　結(jié)論:通過昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)成功構(gòu)建、表達和純化EV71、CA16 VLP，純度可達90%以上。研制的重組V71、CA16雙價VLP疫苗具有良好的免疫原性，