馬兜鈴酸對HepG2細(xì)胞的遺傳毒性及硝化DNA損傷機(jī)制的研究.pdf

1、前言：馬兜鈴酸(aristolochic acid，AA)為馬兜鈴屬植物的主要成分，是植物界發(fā)現(xiàn)的第一個含硝基的有機(jī)物。馬兜鈴屬(Aristolochia)植物廣泛分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)，全世界有200多種，我國約有40種以上。該屬植物藥用價值自古以來就為人所知,被廣泛用于治療各種感染癥、皮膚病、腫瘤、水腫，咳嗽和關(guān)節(jié)痛等。但自1993年比利時的學(xué)者Vanherweghen等首次報道含有AA的中草藥引起進(jìn)行性間質(zhì)性腎纖維化最終導(dǎo)致腎衰以

2、后，其他國家也相繼發(fā)現(xiàn)含AA的中草藥對動物和人具有致癌性。一時間世界各國對含有或懷疑含有AA的中草藥引起了廣泛的關(guān)注。 20世紀(jì)80年代初，體外實驗和動物實驗結(jié)果表明，AA具有較強(qiáng)的致突變和致癌作用。根據(jù)人群資料和動物實驗資料，2002年國際癌癥研究中心(IARC)將含馬兜鈴屬植物的中草藥列為對人的第一類致癌物。 據(jù)報道，鼠傷寒沙門氏菌(Salomonella typhimurium)回復(fù)突變試驗結(jié)果表明，AA對TAl

3、OO、TA1537、IA102菌株是直接致突變物。果蠅試驗結(jié)果表明，AA能引起伴隱性致死(SLRL)、精細(xì)胞染色體缺失、幼蟲體細(xì)胞基因重排。在體外培養(yǎng)哺乳動物細(xì)胞中AA能造成6-硫鳥嘌呤抗性突變、姐妹染色單體互換(SCE)、染色體畸變等結(jié)果陽性。AA還可造成CHO細(xì)胞、小鼠骨髓瘤細(xì)胞、豬上皮細(xì)胞、人淋巴細(xì)胞和HepG2細(xì)胞的DNA損傷，從而導(dǎo)致遺傳毒性。 目前對其機(jī)制研究表明，AA的遺傳毒性及致癌性可能與AA與DNA形成加合物有

4、關(guān)?；钚缘?Reactive Nitrogen Species，RNS)包括一氧化氮(NO)及其同系物如過氧亞硝基陰離子(ON00)等對DNA造成損傷從而導(dǎo)致炎癥、遺傳毒性和致癌性的研究越來越引起人們的重視。受此啟發(fā)，我們對RNS是否也參與AA引起HepG2細(xì)胞的DNA損傷，從而導(dǎo)致遺傳毒性進(jìn)行了進(jìn)一步的探討。本研究選用的HepG2細(xì)胞是來源于人類的肝癌細(xì)胞系，它保存了較完整的生物轉(zhuǎn)化代謝酶的活性，是檢測外來化合物遺傳毒性的理想細(xì)胞系。

5、通過此試驗系統(tǒng)對AA引起的遺傳毒性以及活性氮對DNA造成的損傷進(jìn)行研究，進(jìn)一步為揭示AA的遺傳毒性和致癌性提供實驗依據(jù)。 方法：以HepG2細(xì)胞作為試驗系統(tǒng)。噻唑藍(lán)(MTT)比色法檢測AA的細(xì)胞毒性。單細(xì)胞凝膠電泳(SCGE)試驗檢測AA對DNA造成的損傷。微核(MN)試驗檢測細(xì)胞染色體損傷的情況。2，3-二氨基萘(DAN)法測定細(xì)胞內(nèi)亞硝酸鹽水平，從而間接的反映細(xì)胞內(nèi)NO的生成情況。免疫組化方法檢測細(xì)胞內(nèi)8-OHdG的表達(dá)情況

6、，間接的反映細(xì)胞內(nèi)ONOO的生成情況。 結(jié)果：AA對HepG2細(xì)胞的生長抑制率隨著其濃度的增加而增加，接觸24和48 h的半數(shù)抑制濃度(IC<,50>)分別為132.24和62.2 μM。HepG2細(xì)胞接觸25-200μM．的AA 1 h后，DNA斷裂形成的彗星樣的拖尾、尾DNA含量及尾矩明顯增大，呈劑量依賴關(guān)系，提示DNA鏈發(fā)生明顯斷裂，且隨著AA濃度的增高斷裂程度逐漸增加。HepG2細(xì)胞與12.5-50μM的AA接觸24 h

7、后，細(xì)胞微核率明顯高于未用AA處理的細(xì)胞，且存在劑量依賴關(guān)系。細(xì)胞接觸50-200μM．的AA 1 h后，可引起細(xì)胞內(nèi)亞硝酸鹽的水平明顯增加。50-200μM的AA作用HepG2細(xì)胞3 h后，導(dǎo)致8-OHdG的表達(dá)明顯升高。 結(jié)論：AA對HepG2細(xì)胞具有細(xì)胞毒性，通過彗星試驗和微核試驗表明AA能引起HepG2細(xì)胞DNA鏈的斷裂和染色體的損傷。較高濃度的AA可誘發(fā)HepG2細(xì)胞內(nèi)NO水平和8-OHdG的表達(dá)明顯升高。以上結(jié)果提示