結(jié)核分枝桿菌耐受表面活性物質(zhì)SDS的基因Rv0621的性質(zhì)及功能的深入研究.pdf

1、結(jié)核病一直在全球廣泛流行,嚴重危害著人類健康,其病原菌——結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)在1882年被德國科學(xué)家科赫首次鑒定。20世紀40年代以后,隨著抗結(jié)核藥物的問世和卡介苗的預(yù)防接種,結(jié)核病的發(fā)病率和死亡率均明顯下降。但隨著耐藥菌株的出現(xiàn)、人口老齡化、人類免疫缺陷病毒感染者的增多和免疫抑制劑的應(yīng)用日益普遍,結(jié)核病又呈蔓延趨勢。結(jié)核分枝桿菌進入人體后可能會引起原發(fā)性結(jié)核病,也有可能會在人體

2、內(nèi)持續(xù)感染而不引起被感染者明顯的癥狀,當(dāng)宿主免疫力低下時,潛伏性結(jié)核會被激活為活動性結(jié)核。結(jié)核分枝桿菌的持續(xù)感染與其有效抵抗宿主體內(nèi)的各種脅迫因素有關(guān)。結(jié)核分枝桿菌經(jīng)呼吸道進入人體肺部時,將面臨多種不利因素的脅迫,例如氧化壓力、營養(yǎng)缺乏、低氧、低pH值、肺部表面活性物質(zhì)等。
　　 為了研究結(jié)核分枝桿菌抵抗肺部表面活性物質(zhì)脅迫相關(guān)基因,實驗室前期工作利用大腸桿菌基因組文庫篩選到了抵抗肺部表面活性物質(zhì)類似物十二烷基硫酸鈉SDS的相關(guān)

3、基因Rv0621,該基因編碼結(jié)核分枝桿菌的一個37kDa蛋白,經(jīng)疏水性分析,推測其為具有四個跨膜區(qū)的跨膜蛋白,并具有ATP/GTP結(jié)合位點的保守結(jié)構(gòu)域。我們在結(jié)核分枝桿菌的無毒模式菌株——恥垢分枝桿菌(Mycobacteriumsmegmatis)中進行了Rv0621的性質(zhì)及功能研究,以期尋找Rv0621抵抗肺部表面活性物質(zhì)的機理。
　　 本研究中,從GenBank數(shù)據(jù)庫中獲得MTB H37Rv Rv0621的核苷酸序列,設(shè)計引

4、物,以MTB H37Rv全基因組為模板,體外擴增獲得Rv0621基因,將PCR產(chǎn)物連接到pMD19-T,然后亞克隆至大腸桿菌表達質(zhì)粒pET32a(+)和大腸桿菌-分枝桿菌穿梭質(zhì)粒pNIT(myc),經(jīng)質(zhì)粒雙酶切及測序證明pET32a(+)-Rv0621和pNIT(myc)-Rv0621重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。將重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化入大腸桿菌和恥垢分枝桿菌,分別用IPTG和己內(nèi)酰胺進行誘導(dǎo)表達,用SDS-PAGE和Western-Blot檢測了重組

5、蛋白的表達。為了驗證Rv0621編碼的蛋白是否會增加恥垢分枝桿菌在SDS下的存活率,用MTT法研究了重組菌在0.5%SDS下的存活能力。結(jié)核分枝桿菌作為一種重要的病原微生物,其細胞被膜有著獨特的組成和結(jié)構(gòu),可以通過屏蔽或外排藥物導(dǎo)致該菌的耐藥性,所以我們用藥敏法研究了Rv0621編碼的這一膜蛋白對恥垢分枝桿菌耐受結(jié)核藥物能力的影響。SDS能破壞結(jié)核分枝桿菌富含脂肪酸的細胞被結(jié)構(gòu),Rv0621可能會改變宿主的脂肪酸組分以應(yīng)對這一破壞,所以

6、我們通過氣相色譜檢測了重組菌與空載對照的脂肪酸組成差異并檢測了導(dǎo)致該差異的基因轉(zhuǎn)錄水平。
　　 實驗結(jié)果顯示:Rv0621在大腸桿菌和恥垢分枝桿菌中成功異源表達,Rv0621過表達對恥垢分枝桿菌的生長速率影響不顯著,重組恥垢分枝桿菌在0.5%SDS下的存活率增加,對結(jié)核藥物尤其是利福平的耐受增加,重組恥垢分枝桿菌和空載對照菌的脂肪酸組分存在較大差異,重組恥垢分枝桿菌的十六烷酸和十八烷酸減少,相應(yīng)的不飽和脂肪酸十六碳烯-9-酸和十

7、八碳烯-9-酸增加,經(jīng)RT-PCR驗證,發(fā)現(xiàn)引起該脂肪酸變化的酶的編碼基因MSMEG2938和MSMEG5248的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)。肺泡表面活性物質(zhì)能破壞結(jié)核分枝桿菌富含脂肪酸的細胞被結(jié)構(gòu),而不飽和脂肪酸是微生物的重要組分,在微生物抵抗外界壓力中發(fā)揮著重要作用。我們推測Rv0621重組恥垢分枝桿菌不飽和脂肪酸的增加可能會改變其細胞膜的成分及功能,從而應(yīng)對SDS對恥垢分枝桿菌細胞膜產(chǎn)生的破壞,并對結(jié)核藥物產(chǎn)生屏蔽或外排,影響其進入細胞發(fā)揮作用