鳥分枝桿菌耐受活性氮和活性氧基因的篩選及功能研究.pdf

1、目的:鳥分枝桿菌是細(xì)胞內(nèi)寄生菌，在艾滋病晚期?？砂l(fā)生鳥分枝桿菌的擴(kuò)散性感染。巨噬細(xì)胞作為分枝桿菌的宿主細(xì)胞，其內(nèi)微環(huán)境包含有多種殺（抑）菌機(jī)制，比如酸、活性氧(ROS，如O2、H2O2)和活性氮(RNS，如NO、NO2)、多種溶菌酶、抗菌肽等。這些機(jī)制的存在，理論上可以有效的抑制進(jìn)入巨噬細(xì)胞的病原細(xì)菌。但是，某些病原細(xì)菌在感染早期顯然能夠耐受這些殺（抑）菌機(jī)制，在巨噬細(xì)胞內(nèi)大量繁殖，為后續(xù)全身性的胞外感染奠定基礎(chǔ)。本文通過構(gòu)建鳥分枝桿菌

2、基因組文庫，篩選耐受活性氮和活性氧相關(guān)基因，以探討鳥分枝桿菌適應(yīng)巨噬細(xì)胞的殺（抑）菌機(jī)制，為深入研究鳥分枝桿菌的致病機(jī)理給出新的線索，進(jìn)而為新藥物的開發(fā)提供可能的靶點(diǎn)。
　　方法:(1)利用CTAB法提取鳥分枝桿菌基因組DNA，用Sau3AⅠ部分酶切后與用BamHⅠ酶切并經(jīng)磷酸化處理的pUC19質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，構(gòu)建鳥分枝桿菌基因組文庫;(2)利用生物活性水平篩選方法，通過含有NaNO2的培養(yǎng)液，從鳥分枝桿菌基因組

3、文庫中篩選耐受活性氮的克隆子;(3)對所得的克隆子進(jìn)行測序以獲取插入片段的序列，通過生物信息學(xué)分析獲取插入序列的信息和目的基因;(4)根據(jù)目的基因的開放閱讀框架設(shè)計(jì)引物，利用PCR擴(kuò)增目的基因，與相應(yīng)的表達(dá)載體連接后構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒;(5)重組表達(dá)質(zhì)粒在大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE檢測;(6)分別以NaNO2、GSNO、H2O2、SDS作為脅迫，通過計(jì)算平板菌落數(shù)(CFU)或測定吸光度值，分析重組目的基因的耐受性。(7)

4、利用生物信息學(xué)對目的基因編碼蛋白的理化性質(zhì)、空間結(jié)構(gòu)和功能位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測分析。
　　結(jié)果:構(gòu)建的鳥分枝桿菌基因組文庫滴度為8×103cfu/ml，隨機(jī)挑選10個(gè)克隆進(jìn)行BamHⅠ酶切分析，可見插入片段大小約在100-750bp之間，基本達(dá)到文庫建立的要求。通過含有NaNO2的培養(yǎng)液，從構(gòu)建的鳥分枝桿菌基因組文庫中篩選到一個(gè)耐受活性氮的克隆子，測序結(jié)果分析表明，該克隆子的插入序列有兩個(gè)讀碼框，一個(gè)編碼目的基因（取名為noA），另一個(gè)編

5、碼P49蛋白基因，分別處在插入序列的兩條鏈上。構(gòu)建noA重組表達(dá)質(zhì)粒做NaNO2、GSNO、H2O2、SDS脅迫試驗(yàn)，結(jié)果顯示noA耐受NaNO2、GSNO、H2O2的能力明顯高于對照，而其耐受SDS的能力與對照沒有顯著性差異。
　　結(jié)論:從鳥分枝桿菌基因組文庫中篩選到一個(gè)能抵抗NaNO2、GSNO、H2O2脅迫的基因-noA，這是一個(gè)新型的耐受活性氧和活性氮基因。從預(yù)測的理化性質(zhì)、功能位點(diǎn)及結(jié)構(gòu)特點(diǎn)推斷，noA蛋白有可能成為診斷