小鼠肺腺癌噬菌體抗體庫(kù)的構(gòu)建及靶向干細(xì)胞樣肺腺癌側(cè)群細(xì)胞單鏈抗體的初步篩選.pdf

1、肺癌是嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤，近年來(lái)隨著環(huán)境污染的加重和吸煙人群數(shù)量的快速增加，其發(fā)病率和死亡率逐年攀升。雖然目前針對(duì)肺癌的診斷技術(shù)和以手術(shù)、放化療為主的綜合治療方法取得了較大的進(jìn)步，但總的5年生存率仍僅15％左右，尤以肺腺癌對(duì)放化療不敏感，易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，預(yù)后極差。肺腺癌預(yù)后惡劣的重要原因，一是缺乏有效的早期診斷方法，患者常因早期不能明確診斷而失去手術(shù)根治的機(jī)會(huì)；二是殘存對(duì)放化療不敏感的腫瘤細(xì)胞，導(dǎo)致腫瘤耐藥、復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。因此

2、，從肺腺癌發(fā)生的“起源”著手，探尋高效、特異的早期診斷和治療的新方法，已成為目前醫(yī)務(wù)工作者們關(guān)注和研究的熱點(diǎn)之一。
　　 近年來(lái)的研究表明，腫瘤是一種干細(xì)胞疾病。在腫瘤組織中存在一小群具有干細(xì)胞特性的細(xì)胞，能夠無(wú)限增殖和自我更新，產(chǎn)生大量的分化細(xì)胞，最終導(dǎo)致腫瘤形成。目前已從多種腫瘤組織中成功分離出腫瘤干細(xì)胞，包括白血病、黑色素瘤、腦膠質(zhì)瘤、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌和結(jié)腸癌等。這些腫瘤干細(xì)胞具有無(wú)限增殖、自我更新和分化能力，被認(rèn)

3、為是腫瘤發(fā)生的始動(dòng)因素，也是腫瘤放化療抵抗、復(fù)發(fā)和侵襲轉(zhuǎn)移的根源。如能在腫瘤發(fā)生的始動(dòng)階段找到針對(duì)腫瘤干細(xì)胞的靶向檢測(cè)和治療策略，則將大大推進(jìn)腫瘤的早期診斷和治療，進(jìn)而改善其預(yù)后。
　　 腫瘤靶向研究成功與否的關(guān)鍵在于靶點(diǎn)的選擇和抗體的制備。傳統(tǒng)的雜交瘤技術(shù)不僅制備過(guò)程繁瑣、費(fèi)時(shí)，而且產(chǎn)生的抗體具有分子質(zhì)量大、穿透能力弱、靶/非靶比值低、血清清除慢等缺陷。噬菌體展示技術(shù)的出現(xiàn)將基因工程抗體技術(shù)帶入了一個(gè)新的發(fā)展階段。它能在體外模

4、擬抗體生成過(guò)程，產(chǎn)生的單鏈抗體具有分子量小、免疫原性低，組織穿透力強(qiáng)以及血清清除快等優(yōu)點(diǎn)。
　　 因此，本課題擬嘗試應(yīng)用噬菌體展示技術(shù)構(gòu)建小鼠肺腺癌單鏈抗體庫(kù)，并用小鼠干細(xì)胞樣肺腺癌側(cè)群(side population，SP)細(xì)胞對(duì)文庫(kù)進(jìn)行初步篩選，探索制備靶向肺腺癌干細(xì)胞抗體的新途徑，為靶向肺腺癌干細(xì)胞的早期診療手段提供新的思路。
　　 目的：通過(guò)噬菌體抗體展示技術(shù)制備靶向小鼠干細(xì)胞樣肺腺癌側(cè)群細(xì)胞的單鏈抗體，并初步研

5、究其免疫學(xué)活性，為探尋靶向肺腺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞的的早期診療手段奠定基礎(chǔ)。
　　 方法與結(jié)果：
　　 第一部分小鼠干細(xì)胞樣肺腺癌側(cè)群細(xì)胞的分離和鑒定
　　 1.小鼠肺腺癌SP細(xì)胞的分選：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的小鼠Lewis肺腺癌(Lewis lung cancer，LLC)細(xì)胞，利用Hoechst33342和Propidium iodide(PI)雙染流式分選LLCSP細(xì)胞，并將其懸浮培養(yǎng)于含有bFGF、EGF和胰島素的無(wú)血

6、清培養(yǎng)基。
　　 2干細(xì)胞樣.LLC SP細(xì)胞的鑒定：利用體外培養(yǎng)成球?qū)嶒?yàn)、MMT檢測(cè)增殖、克隆形成實(shí)驗(yàn)、耐藥實(shí)驗(yàn)、誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)檢測(cè)分選出來(lái)的SP和non SP細(xì)胞的自我更新和分化能力，并用RT-PCR檢測(cè)相關(guān)干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于non-SP細(xì)胞，SP細(xì)胞可在無(wú)血清培養(yǎng)基中懸浮成球生長(zhǎng)，在含血清培養(yǎng)基中可誘導(dǎo)分化為貼壁細(xì)胞，具有更強(qiáng)的增殖能力、耐藥能力和致瘤能力，并高表達(dá)CD44、ABCG2和O

7、CT-4等干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物，表明LLC SP細(xì)胞具有干性。
　　 第二部分小鼠肺腺癌噬菌體抗體庫(kù)的構(gòu)建
　　 1.條件性基因敲除小鼠肺腺癌模型的建立：大量擴(kuò)增重組腺病毒AdCre后，利用鼻腔吸入法感染Lox-stop-lox K-ras G12D小鼠，5天一次，重復(fù)3次，30天后處死小鼠，取全肺組織固定、包埋、切片后進(jìn)行HE染色。鏡下觀察可見(jiàn)小鼠肺組織出現(xiàn)重度不典型增生，并有散在癌巢。
　　 2.小鼠肺腺癌單鏈抗

8、體庫(kù)的構(gòu)建：以發(fā)生肺腺癌的Lox-stop-lox K-ras G12D小鼠脾臟組織作為B細(xì)胞的來(lái)源，提取脾臟總RNA。根據(jù)文獻(xiàn)設(shè)計(jì)引物，用RT-PCR的方法擴(kuò)增抗體重鏈(VH)和輕鏈(VL)可變區(qū)基因。利用SOE-PCR技術(shù)將它們與Linker拼接，再引入酶切位點(diǎn)SfiⅠ和NotⅠ，純化回收SOE-PCR產(chǎn)物即得到scFv基因。結(jié)果顯示：提取的脾臟總RNA進(jìn)行瓊脂糖電泳，可見(jiàn)清晰的28S、18S條帶；擴(kuò)增的VH基因共5條，大小約350

9、bp，VL基因共4條，大小約320bp，拼接組裝后的scFv基因共20條，大小約為750bp。
　　 3.scFv基因與噬菌粒載體pCANTAB-5E的拼接和鑒定：純化的scFv基因經(jīng)SfiⅠ和NotⅠ雙酶切后，膠回收純化，與同樣經(jīng)SfiⅠ和NotⅠ雙酶切的噬菌粒載體pCANTAB-5E連接。連接產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1感受態(tài)細(xì)胞，獲得庫(kù)容為1.7×108的抗體庫(kù)。隨機(jī)進(jìn)行挑取單克隆進(jìn)行PCR和酶切鑒定，陽(yáng)性插入率為86.36％

10、(19/22)。
　　 4.噬菌體抗體庫(kù)的展示：對(duì)上一步鑒定有陽(yáng)性克隆的電轉(zhuǎn)產(chǎn)物進(jìn)行M13K07輔助噬菌體超感染，在無(wú)糖環(huán)境下誘導(dǎo)單鏈抗體庫(kù)的噬菌體展示。重組噬菌體抗體庫(kù)的滴度達(dá)到1012cfu/ml。
　　 第三部分小鼠干細(xì)胞樣肺腺癌側(cè)群細(xì)胞噬菌體單鏈抗體的初步篩選
　　 1.LLC SP細(xì)胞對(duì)抗體庫(kù)的富集：先以小鼠肺腺癌LLC細(xì)胞對(duì)抗體庫(kù)進(jìn)行負(fù)性篩選后，再用分選得到的干細(xì)胞樣LLC SP細(xì)胞對(duì)噬菌體抗體庫(kù)進(jìn)行

11、正性篩選，共進(jìn)行了4輪富集。對(duì)噬菌體抗體庫(kù)富集前后滴度測(cè)定結(jié)果表明，收獲的噬菌體滴度逐漸升高。第1輪淘篩噬菌體收獲率為1.37×10-9，第4輪為2.47×10-7，第4輪收獲率約為第1輪的180倍。
　　 2.細(xì)胞ELISA檢測(cè)噬菌體抗體的免疫活性：用細(xì)胞ELISA測(cè)定篩選到的噬菌體抗體抗原結(jié)合活性及特異性，結(jié)果顯示有5個(gè)噬菌體抗體具有較高的結(jié)合能力和特異性，能與干細(xì)胞樣LLC SP細(xì)胞結(jié)合，P/N值大于2。
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12、.免疫組化檢測(cè)噬菌體抗體的免疫活性：用免疫組化進(jìn)一步檢測(cè)ELISA陽(yáng)性噬菌體抗體抗原結(jié)合活性及特異性，陽(yáng)性克隆所展示的抗體可與干細(xì)胞樣LLC SP細(xì)胞結(jié)合，DAB顯色呈棕色深染。
　　 結(jié)論：本研究通過(guò)噬菌體抗體展示技術(shù)制備靶向小鼠干細(xì)胞樣肺腺癌側(cè)群細(xì)胞的單鏈抗體，并通過(guò)ELISA和免疫組化方法進(jìn)行了初步驗(yàn)證，結(jié)果表明利用噬菌體展示技術(shù)直接從肺腺癌小鼠脾臟中獲得RNA，制備單鏈抗體，較傳統(tǒng)的雜交瘤技術(shù)方法更為簡(jiǎn)便、省時(shí)。初步鑒定