紅茶和綠茶多酚與豬胰腺α-淀粉酶相互作用的酶催化動力學和熒光猝滅研究.pdf

1、目的：本研究旨在以豬胰腺α-淀粉酶(porcine pancreaticα-amylase，PPA)作為人唾液α-淀粉酶(human salivaryα-amylases，HSA)的蛋白質(zhì)模型，通過酶的動力學和熒光猝滅實驗，從分子水平考察紅/綠茶茶多酚(tea polyphenols，TP)抑制PPA催化水解淀粉的效果和特異性，以及對PPA蛋白質(zhì)內(nèi)源性熒光的猝滅效果，從而為解釋紅/綠茶TP對口腔感覺的收斂性作用和酶抑制類型的生理意義奠定

2、理論基礎(chǔ)。 方法：在不間斷540nm波長下，測量PPA催化生成的麥芽糖的吸光度增加值，通過動力曲線的直線段的斜率獲得反應速度，由Lineweaver-Burk圖求出動力學參數(shù)(Vmax和Ks)，統(tǒng)計學分析確定抑制類型。滴加不同濃度的紅/綠茶TP溶液，以295nm波長(λex)檢測PPA的熒光強度，通過獲得的熒光光譜計算Stern-Volmer猝滅常數(shù)(Ksv)、雙分子猝滅常數(shù)(kq)、表觀靜態(tài)猝滅常數(shù)(Kapp)、動態(tài)猝滅常數(shù)(

3、KD)和靜態(tài)猝滅常數(shù)(KS)。 結(jié)果：無抑制劑和紅茶抑制劑的最大反應速度(Vmax)之間的差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，無抑制劑和綠茶抑制劑的酶-底物解離常數(shù)(Ks)之間的差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。紅茶抑制劑解離常數(shù)(Ki)值高于綠茶(P<0.05)。同一品牌TP的動、靜態(tài)猝滅常數(shù)(KD與Ks)之間的差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；雙分子猝滅常數(shù)(kq)大于雙分子擴散限制性猝滅常數(shù)值(1×1040M-1s-1

4、)，伴隨紅/綠茶TP溶液濃度增加，熒光發(fā)射波長(λem)發(fā)生紅移。紅/綠茶多酚與PPA在Trp59上存在一個結(jié)合位點(n=1)。紅/綠茶猝滅劑對PPA熒光猝滅的距離作用的K存在統(tǒng)計學意義(P<0.05)，紅茶的表觀猝滅常數(shù)大于綠茶(P<0.05)。 結(jié)論：紅茶TP對PPA的抑制為非競爭性抑制型，綠茶TP對PPA的抑制為競爭性抑制型。紅茶抑制劑既能與自由酶的活化中心位點結(jié)合，也能與酶-底物上的位點結(jié)合，而綠茶抑制劑僅能與活化中心位