RLIP6對(duì)人膠質(zhì)細(xì)胞瘤生物學(xué)行為及化療藥物敏感性的影響.pdf

1、惡性星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤（多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和間變性星形細(xì)胞瘤）在成人的中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)腫瘤中是最常見(jiàn)的原發(fā)性惡性腫瘤，年發(fā)病率約0.005％。雖然相對(duì)其他系統(tǒng)腫瘤比較罕見(jiàn)，但相對(duì)于其他中樞神經(jīng)腫瘤其有較高的發(fā)病率及致死率，這也是膠質(zhì)瘤成為神經(jīng)外科腫瘤焦點(diǎn)問(wèn)題的重要原因之一。即使臨床通過(guò)各種治療手段，包括手術(shù)切除、放療及化療，在過(guò)去5年中其中位生存期僅為14-15個(gè)月。主要原因是由于臨床膠質(zhì)瘤對(duì)放、化療耐藥較為常見(jiàn)，由以惡性膠質(zhì)瘤尤甚，目前總

2、體療效仍理想。既往實(shí)驗(yàn)現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)某些特定基因（包括癌基因及抑癌基因MGMT，Survivin和p53等）的異常表達(dá)可影響膠質(zhì)瘤的放療及化療耐藥性。然而目前認(rèn)為單個(gè)基因的異常調(diào)控及表達(dá)并不能準(zhǔn)確預(yù)測(cè)膠質(zhì)瘤對(duì)輔助治療（放化療）的敏感程度并預(yù)示患者預(yù)后，膠質(zhì)瘤對(duì)輔助治療的反應(yīng)性往往由多個(gè)基因的改變決定，因此，尋找新的耐藥基因并闡明其分子耐藥機(jī)制已成為神經(jīng)外科研究的熱點(diǎn)之一。
　　 RLIP76是一個(gè)ATP依賴非ABC轉(zhuǎn)運(yùn)的運(yùn)輸不同結(jié)構(gòu)的

3、化合物。自從發(fā)現(xiàn)Rlip76具有轉(zhuǎn)運(yùn)功能后，許多研究表明Rlip76在化療藥物轉(zhuǎn)運(yùn)和抗癲癇藥物轉(zhuǎn)運(yùn)上有重要的作用。他的底物范圍包括弱陽(yáng)離子化合物（DOX，VBL，VCR，VRL，秋水仙堿，sunitinib和sorafenib）和陰離子代謝物（如谷胱甘肽結(jié)合物的電子性）。由于RLIP76具有廣泛的底物特異性，在不同組織中廣泛表達(dá)，特別是在腫瘤組織中表達(dá)明顯，這使得Rlip76在調(diào)節(jié)內(nèi)生和異生代謝終端產(chǎn)物起到重要作用。除了上述功能，RLI

4、P76也具有多種生理功能。Ral連接RLIP76后啟動(dòng)了后者對(duì)CDC42的GTP酶激活蛋白活性。Ral能調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和存活。CDC42是Rho-GTP酶類成員之一，它對(duì)細(xì)胞形態(tài)發(fā)生和細(xì)胞遷移起重要作用。RLIP76連接AP2和POB1后抑制網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的胞吞現(xiàn)象，它還能抑制對(duì)表皮生長(zhǎng)因子受體、胰島素受體和腫瘤生長(zhǎng)因子的內(nèi)化作用，RLIP76對(duì)這些受體的調(diào)節(jié)都能影響該受體介導(dǎo)的正常信號(hào)傳導(dǎo)通路。由于RLIP76是多種信號(hào)通路調(diào)節(jié)的關(guān)鍵因

5、子，而這些通路往往能夠調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移、分裂和凋亡，因此更多對(duì)RLIP76的研究有助于理解這些復(fù)雜的生理機(jī)制。
　　 本研究擬檢測(cè)RLIP76在不同病理級(jí)別腦膠質(zhì)瘤以及惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中的確切表達(dá)情況，并通過(guò)構(gòu)建RLIP76慢病毒干擾及過(guò)表達(dá)載體并感染膠質(zhì)瘤細(xì)胞株，建立RLIP76不同表達(dá)水平的膠質(zhì)瘤細(xì)胞株，聯(lián)合建立裸鼠體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ鸵匝芯縍LIP76在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的可能起到的作用，并將敲除RLIP76基因的U87和U

6、251膠質(zhì)瘤細(xì)胞與替莫唑胺(temozolomide TMZ)藥物培養(yǎng)，檢查腫瘤的耐藥相關(guān)基因MDR、MRP，凋亡的相關(guān)蛋白以及化療敏感性，研究RLIP76基因在化療耐藥中的作用。本實(shí)驗(yàn)共分為五個(gè)部分:第一部分，RLIP76在不同級(jí)別星型細(xì)胞膠質(zhì)瘤瘤組織中的表達(dá)水平以及與患者預(yù)后的相關(guān)性;第二部分，利用RLIP76慢病毒干擾及過(guò)表達(dá)載體感染膠質(zhì)瘤細(xì)胞株，構(gòu)建RLIP76不同表達(dá)水平的細(xì)胞株;觀察其對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株增殖、凋亡、侵襲性的影響;

7、第三部分，構(gòu)建裸鼠成瘤模型，研究RLIP76-shRNA聯(lián)合TMZ治療對(duì)裸鼠移植瘤的治療效果;第三部分，通過(guò)siRNA干擾RLIP76的表達(dá)，研究RLIP76-Rac1-JNK通路對(duì)膠質(zhì)瘤增殖、凋亡的影響;第五部分，慢病毒靶向性抑制RLIP76表達(dá)與替莫唑胺化療藥物共同培養(yǎng)，觀察RLIP76蛋白表達(dá)對(duì)膠質(zhì)細(xì)胞瘤化療敏感性的影響。
　　 第一部分RLIP76在腦星型膠質(zhì)瘤中的表達(dá)研究
　　 目的:研究RLIP76在不同級(jí)別

8、腦膠質(zhì)瘤組織中的mRNA和蛋白表達(dá)水平以及對(duì)患者預(yù)后的影響。
　　 方法:應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)RLIP76在99例不同級(jí)別星型膠質(zhì)細(xì)胞瘤的蛋白表達(dá)水平。應(yīng)用real-time PCR檢測(cè)RLIP76mRNA的在28例不同級(jí)別腦星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤的表達(dá)水平。應(yīng)用Western blot檢測(cè)RLIP76的在28例不同級(jí)別腦星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤的蛋白表達(dá)水平。利用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法驗(yàn)證其對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者預(yù)后的影響，并證明其與Ki-67和Rac1蛋

9、白表達(dá)之間的關(guān)系。
　　 結(jié)果: RLIP76蛋白表達(dá)主要分布在細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)，Rac1、JNK蛋白表達(dá)主要分布在細(xì)細(xì)胞質(zhì)，Ki-67蛋白主要位于細(xì)胞核。4種蛋白在低級(jí)別腫瘤染色陽(yáng)性率較低，而高級(jí)別腫瘤陽(yáng)性率較高Ki-67作為細(xì)胞增殖指數(shù)，能夠標(biāo)記G和S期的細(xì)胞，多數(shù)腫瘤細(xì)胞強(qiáng)表達(dá)，免疫組化提示RLIP76與Ki-67成明顯正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=0.581(P＜0.001 by Spearman's correlation Coe

10、fficient)。RLIP76與Rac1在63例膠質(zhì)母細(xì)胞瘤成明顯正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=0.314(P＜0.001 by Spearman's correlation Coefficient)。RLIP76與Rac1的mRNA在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中表達(dá)表達(dá)明顯上調(diào)，與低級(jí)別相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而JNK的表達(dá)在兩個(gè)不同級(jí)別膠質(zhì)瘤中無(wú)明顯差異Western-blot與免疫組化結(jié)果相似，結(jié)果顯示RLIP76、Rac1、JNK蛋白水

11、平在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中表達(dá)表達(dá)明顯上調(diào)，與低級(jí)別相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。單因素方差分析提示RLIP76的表達(dá)、Rac1的表達(dá)及年齡與預(yù)后相關(guān)，而腫瘤大小與性別與預(yù)后無(wú)關(guān)，而將單因素分析的結(jié)果中P＜0.2的因素納入多因素分析發(fā)現(xiàn)，RLIP76的表達(dá)與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者預(yù)后有顯著性關(guān)系。
　　 結(jié)論:RLIP76隨著膠質(zhì)瘤病理級(jí)別的增高而增高，并與患者的預(yù)后明顯相關(guān)。
　　 第二部分RLIP76表達(dá)對(duì)膠質(zhì)瘤增殖、侵襲

12、和凋亡的影響
　　 目的:通過(guò)慢病毒載體靶向抑制和過(guò)表達(dá)RLIP76基因，探討RLIP76對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U87、U251、星型膠質(zhì)瘤SW1088細(xì)胞株生長(zhǎng)、增殖和凋亡的作用。
　　 方法:利用RLIP76慢病毒干擾及過(guò)表達(dá)載體感染U87、U251、SW1088細(xì)胞株，分別抑制和過(guò)表達(dá)RLIP76，構(gòu)建RLIP76干擾及過(guò)表達(dá)的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系。MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖，AV/PI染色測(cè)定細(xì)胞凋亡，Transwell試驗(yàn)檢測(cè)

13、侵襲性改變。RT-PCR和Western blot測(cè)定RLIP76異常表達(dá)的細(xì)胞株MDR1、MRP1、Bcl-2、Caspase-3等基因mRNA和蛋白表達(dá)水平變化。
　　 結(jié)果:Rlip76過(guò)表達(dá)及shRNA干擾載體構(gòu)建正確，病毒包裝成功，滴度分別為4.0×107TU/ml和6.0×107TU/ml。Lenti-Rlip76和Lenti-shRNA病毒感染U251細(xì)胞后可以顯著上調(diào)或下調(diào)Rlip76的表達(dá)。在U251細(xì)胞株中，

14、Rlip76過(guò)表達(dá)組與空白對(duì)照組及空載體組相比，在72、96及120小時(shí)能夠促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(72h:1.13±0.012 vs1.10±0.04 vs1.24±0.012, p＜0.05;96h:1.65±0.017 vs1.60±0.041 vs1.84±0.016, p＜0.05;120h:1.83±0.009 vs1.81±0.031 vs2.10±0.016, p＜0.05),Rlip76干擾組之后與空白對(duì)照組及空載

15、體組相比，在72、96及120小時(shí)能夠抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(72h:1.13±0.012 vs1.10±0.04 vs0.84±0.01，p＜0.05;96h:1.66±0.017vs1.60±0.041 vs1.16±0.04, p＜0.05;120h:1.83±0.009 vs1.81±0.031 vs1.34±0.016,p＜0.05)。在U87細(xì)胞株中抑制RLIP76表達(dá)能抑制其細(xì)胞生長(zhǎng)，而在SW1088中過(guò)表達(dá)RLIP7

16、6蛋白能促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)。在U251細(xì)胞株中，Rlip76過(guò)表達(dá)組與空白對(duì)照組及空載體組相比，在72小時(shí)后能夠抑制細(xì)胞凋亡，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(5.63±0.21 vs5.6±0.1 vs3.3±0.12，p＜0.05)，Rlip76干擾組之后與空白對(duì)照組及空載體組相比，在72小時(shí)后能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(5.63±0.21 vs5.6±0.1 vs11.8±0.3，p＜0.05)。在U87細(xì)胞株中抑制RLIP76表達(dá)能促進(jìn)其細(xì)胞凋亡，而

17、在SW1088中過(guò)表達(dá)RLIP76蛋白能抑制細(xì)胞凋亡。在U251細(xì)胞株中，Rlip76抑制組與空白對(duì)照組及空載體組相比，能夠顯著抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲(27±1 vs25.67±0.58 vs11.67±0.578，p＜0.05)，在U87細(xì)胞株中，抑制RLIP76表達(dá)同樣能夠抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲(22.63±2.08 vs24.67±1.53 vs13.33±2.08，p＜0.05)。TEM觀察RLIP76抑制后的U87及U251膠質(zhì)瘤細(xì)

18、胞可見(jiàn)凋亡細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生改變，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，細(xì)胞核深染，基核固縮，染色質(zhì)凝集、邊聚、核碎裂，并形成凋亡小體。Western-blot結(jié)果顯示，在U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞中抑制RLIP76的表達(dá)，可使腫瘤細(xì)胞內(nèi)Bcl-2、survivin的蛋白表達(dá)水平下調(diào)(p＜0.05);Caspase-3的表達(dá)水平明顯增加(p＜0.05)，而p53蛋白的表達(dá)同對(duì)照組及空載體組相比無(wú)明顯差異(p＞0.05)。而在U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞中促進(jìn)RLIP76的表達(dá)，可使腫

19、瘤細(xì)胞內(nèi)Bcl-2、survivin的蛋白表達(dá)水平上調(diào)(p＜0.05);Caspase-3的表達(dá)水平明顯下降(p＜0.05)，p53蛋白的表達(dá)同對(duì)照組及空載體組相比同樣無(wú)明顯差異(p＞0.05)。在U87中轉(zhuǎn)染RLIP76 shRNA表達(dá)進(jìn)一步證實(shí)抑制RLIP76表達(dá)能抑制Bcl-2、survivin的蛋白表達(dá)，促進(jìn)Caspase-3的表達(dá)水平;在SW1088中轉(zhuǎn)染 Lenti-RLIP76同樣證實(shí)抑制RLIP76表達(dá)能促進(jìn)Bcl-2、

20、survivin的蛋白表達(dá)，抑制Caspase-3的表達(dá)水平。
　　 結(jié)論:RLIP76的表達(dá)可影響膠質(zhì)瘤的增殖、凋亡與侵襲，與凋亡因子Bcl-2、survivin、Caspase-3密切相關(guān)。
　　 第三部分RLIP76對(duì)U251膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株裸鼠移植瘤影響的初步研究
　　 目的:建立U251細(xì)胞裸鼠成瘤模型，觀察抑制RLIP76蛋白對(duì)U251細(xì)胞株裸小鼠成瘤能力的影響并初步觀察RLIP76-shRNA聯(lián)合

21、Temozolomide治療對(duì)裸鼠U251細(xì)胞移植瘤的影響。
　　 方法:隨機(jī)選取18只裸鼠分3組每組6只，分別皮下接種2×106個(gè)U251、U251-GFP、U251-Lenti-RLIP76、U251-Lenti-GFP、U251-shRNA細(xì)胞，觀察shRNA對(duì)U251成瘤能力的影響。觀察腫瘤體積變化并記錄，待裸鼠自然死亡后取得腫瘤組織，將腫瘤組織制成石蠟切片，TUNEL染色分析腫瘤內(nèi)凋亡。
　　 結(jié)果:裸鼠生存時(shí)

22、間結(jié)果顯示，U251對(duì)照組、干擾陰性對(duì)照組及過(guò)表達(dá)陰性對(duì)照組中位生存時(shí)間分別為49、51、49天，而RLIP76抑制組裸鼠中位生存時(shí)間長(zhǎng)達(dá)134天，RLIP76過(guò)表達(dá)組中位生存時(shí)間僅為26天，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。裸鼠死亡后取其腫瘤行腫瘤體積檢測(cè)，結(jié)果顯示U251對(duì)照組、干擾陰性對(duì)照組及過(guò)表達(dá)陰性對(duì)照組腫瘤平均體積分別為0.032cm3±0.004、0.030cm3±0.002、0.033cm3±0.004，RLIP76抑制

23、組裸鼠腫瘤平均體積為0.054cm3±0.004，RLIP76過(guò)表達(dá)組平均體積為0.011cm3±0.004，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。裸鼠死亡后取其腫瘤行TUNEL檢測(cè)，結(jié)果顯示U251對(duì)照組、干擾陰性對(duì)照組及過(guò)表達(dá)陰性對(duì)照組腫瘤平均體積分別為37.34±1.01、41.68±1.13、39.66±0.7，RLIP76抑制組裸鼠腫瘤平均體積為83.76±2，RLIP76過(guò)表達(dá)組平均體積為20.47±1.3，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p

24、＜0.05)。裸鼠死亡后取其腫瘤行BrdU檢測(cè)，結(jié)果顯示U251對(duì)照組、干擾陰性對(duì)照組及過(guò)表達(dá)陰性對(duì)照組腫瘤染色率分別為27.56±1.16、28.78±0.86、29.33±0.75，RLIP76抑制組裸鼠腫瘤平均體積為8.64±1，RLIP76過(guò)表達(dá)組平均體積為53.59±1.68，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。RLIP76基因在裸鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤中的表達(dá)(×200)。免疫組化結(jié)果顯示RLIP76、Rac1在RLIP76抑制組中

25、與對(duì)照組相比表達(dá)明顯降低，而在RLIP76過(guò)表達(dá)組中RLIP76、Rac1蛋白表達(dá)明顯升高，這與臨床標(biāo)本免疫組化檢驗(yàn)結(jié)果一致。
　　 結(jié)論:在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中抑制RLIP76的表達(dá)可以延長(zhǎng)裸鼠生存時(shí)間并抑制其增殖，促進(jìn)腫瘤的凋亡。
　　 第四部分RLIP76經(jīng)Rac1-JNK通路對(duì)U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞株增殖、凋亡的研究
　　 目的:研究靶向RLIP76的siRNA轉(zhuǎn)染U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞株后，Rac1-JNK對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增

26、殖凋亡改變。
　　 方法:將鑒定有效的靶向RLIP76的siRNA的轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞株，Western Blot法檢測(cè)Rac1和JNK的蛋白表達(dá)水平。檢測(cè)Rac1早RLIP76抑制后倒入野生型RLIP76、GAP酶失活性RLIP76和ATP酶失活后的泛素化改變，Western Blot法檢測(cè)各蛋白的活性及蛋白表達(dá)的改變程度情況并同時(shí)檢測(cè)影響其表達(dá)后的凋亡增殖情況。
　　 結(jié)果: GAP失活的RLIP76(R208L/K2

27、44R)仍然具有野生型RLIP76的功能，可以抑制Rac1蛋白的活性，并增加腫瘤細(xì)胞的克隆形成降低其凋亡率。這說(shuō)明若是單單抑制RLIP76的GAP功能，其仍具有野生型蛋白R(shí)LIP76功能，可促進(jìn)腫瘤增殖。ATP失活的RLIP76(K74M/K425M)不具有野生型RLIP76(WT)的功能，對(duì)Rac1蛋白的活性無(wú)影響，在U251細(xì)胞株中抑制RLIP76的表達(dá)，可下調(diào)Rac1-GTP、Rac1和活性p-JNK蛋白的表達(dá)，我們研究發(fā)現(xiàn)野生型

28、RLIP76(WT)及GAP失活性RLIP76(R208L/K244R)均能降低其對(duì)Rac1泛素化的作用，使其在單體Rac1表達(dá)程度增加(30kd)，而ATP失活性RLIP76蛋白(K74M/K425M)均能增加其對(duì)Rac1泛素化的作用，Rac1泛素化作用的增加能降低其活性，抑制對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的作用。這說(shuō)明RLIP76對(duì)腫瘤增殖、凋亡的作用主要依靠其ATP的活性功能，針對(duì)RLIP76-ATP功能的抑制可稱為膠質(zhì)瘤靶向治療的目標(biāo)之一。

29、r>　　 結(jié)論:RLIP76通過(guò)Rac1-JNK通路調(diào)控膠質(zhì)瘤的增殖與凋亡。GAP酶活性缺失的RLIP76突變體可影響膠質(zhì)瘤的增殖凋亡，而ATP酶活性缺失的RLIP76突變體不能影響膠質(zhì)瘤的增殖與凋亡。
　　 第五部分RLIP76異常表達(dá)對(duì)U87、U251膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株Temozolomide敏感性的影響
　　 目的:研究靶向RLIP76的siRNA轉(zhuǎn)染U87、U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞株后，細(xì)胞對(duì)TMZ敏感性的改變。

30、r>　　 方法:將鑒定有效的靶向RLIP76的siRNA的轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞株，Western Blot法檢測(cè)耐藥相關(guān)蛋白Bcl-2、Caspase-3表達(dá)水平。構(gòu)建MDR以及MRP的引物，RT-PCR測(cè)定其表達(dá)。MTT法測(cè)定靶向RLIP76的siRNA的轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞與化療藥物TMZ培養(yǎng)后的增殖水平并檢測(cè)其IC50水平。TUNEL檢測(cè)其聯(lián)合培養(yǎng)后的凋亡情況。
　　 結(jié)果:通過(guò)3天MTT法測(cè)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率計(jì)算IC50，在U

31、87和U251細(xì)胞株中單獨(dú)運(yùn)用Temozolomide的耐藥指數(shù)分別為7.77±1.78ug/mL和46.68±1.99ug/mL，U87、U251的空載體組與Temozolomide聯(lián)合用藥的耐藥指數(shù)分別為7.37±1.07ug/mL和48.20±1.77 ug/mL，聯(lián)合運(yùn)用干擾RLIP76表達(dá)與Temozolomide后U87和U251細(xì)胞對(duì)Temozolomide的耐藥指數(shù)分別為4.08±1.99 and23.68±2.59ug

32、/mL，聯(lián)合Temozolomide與抑制RLIP76蛋白能顯著增加膠質(zhì)瘤對(duì)Temozolomide的敏感性，同時(shí)其作用機(jī)制主要是由于增加了膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡率，主要可能與顯著降低Bcl-2蛋白和增加Caspase-3蛋白的表達(dá)有關(guān)。同樣我們排除了多要耐藥蛋白對(duì)Temozolomide化療敏感性的影響，這證明雖然RLIP76同樣為轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，但并不影響其他轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)化療藥物的作用，可作為獨(dú)立的化療增敏劑增加臨床的化療效果。
　　 結(jié)