骨髓基質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)小鼠白介素-18治療大鼠腦膠質(zhì)瘤的實驗研究.pdf

1、本課題研究主要內(nèi)容是：利用BMSCs的腫瘤趨向性特點和IL-18的抑制腫瘤生長的功能，構(gòu)建攜帶IL-18的復(fù)制缺陷型腺病毒載體，轉(zhuǎn)染BMSCs，然后移植入9L膠質(zhì)瘤細(xì)胞建立的Fisher344大鼠膠質(zhì)瘤模型中，觀察攜帶IL-18的BMSCs對腦膠質(zhì)瘤的治療作用，為腦膠質(zhì)瘤的基因治療探尋新的思路和策略。本研究主要包括三部分。 第一部分、重組腺病毒載體Ad-mIL-18的構(gòu)建及包裝 目的：構(gòu)建表達(dá)mIL-18的復(fù)制缺陷型腺病

2、毒載體，并進(jìn)行包裝、鑒定、純化及滴度測定為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。 方法：限制性內(nèi)切酶HindIII、EcoRV分別消化真核表達(dá)質(zhì)粒Pcr3.1uni-mIL-18和穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV，瓊脂糖凝膠電泳回收、純化目的片段，T4連接酶連接，構(gòu)建出穿梭質(zhì)粒pAdTrack-mIL-18。氯化鈣法制備含有骨架質(zhì)粒pAdEasy-1的大腸桿菌BJ5183感受態(tài)細(xì)胞；重組穿梭質(zhì)粒pAdTrack-mIL-18經(jīng)限制性內(nèi)切酶HindI

3、II、EcoRV和基因測序鑒定正確后：用限制性內(nèi)切酶PmeI線性化處理后與上述感受態(tài)細(xì)胞在細(xì)菌中進(jìn)行同源性重組，構(gòu)建復(fù)制缺陷型腺病毒載pAd-mIL-18。PacI線性化處理后在人胚腎(Humanembryonickidney293，HEK293)細(xì)胞中進(jìn)行包裝，PCR法對重組子進(jìn)行鑒定、氯化銫法純化、倍比稀釋法檢測病毒滴度。 結(jié)果：成功構(gòu)建了復(fù)制缺陷型腺病毒載體pAd-mIL-18；并在KEK293細(xì)胞中完成包裝；經(jīng)鑒定病毒液

4、中包含mIL-18的完整序列，倍比稀釋法檢測病毒滴度為2.45×1010pFU/ml。 結(jié)論： (1)“兩步法”細(xì)菌內(nèi)同源性重組構(gòu)建復(fù)制缺陷型腺病毒載體具有成功率高、方法簡便、快捷、實驗周期短等優(yōu)點。 (2)HEK293細(xì)胞包裝重組腺病毒技術(shù)成熟、結(jié)果穩(wěn)定、可靠。 (3)倍比稀釋法檢測病毒滴度，簡單、可靠；氯化銫法純化病毒滴度高，能夠滿足體內(nèi)外實驗的需求。 第二部分、Fisher344大鼠骨髓基質(zhì)

5、干細(xì)胞的體外擴(kuò)增及鑒定 目的：建立一種簡便可行的Fisher344大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(Bonemarrowstromastemcells，BMSCs)體外培養(yǎng)、擴(kuò)增方法，并對其免疫表型、細(xì)胞周期、生長曲線、超微結(jié)構(gòu)、等方面進(jìn)行初步分析。 方法：應(yīng)用密度梯度離心法分離Fisher344大鼠BMSCs，條件培養(yǎng)基培養(yǎng)。倒置相差顯微鏡下觀察BMSCs形態(tài)學(xué)變化；流式細(xì)胞儀檢測BMSCs的表面標(biāo)記以及細(xì)胞周期：MTT法檢測BMS

6、Cs的增殖；掃描電鏡和透射電鏡觀察BMSCs的超微結(jié)構(gòu)。 結(jié)果：密度梯度離心法分離出的BMSCs純度較高。典型的BMSCs貼壁生長，以長梭形為主，體積小，核漿比大，呈明顯的同向性改變，漩渦狀盤旋排列。細(xì)胞存活率均大于95％。流式細(xì)胞儀檢測BMSCsCD29陽性表達(dá)細(xì)胞比率為95.3％，CD34陽性細(xì)胞比率為1.8％，CD44陽性細(xì)胞比率為94.7％，CD45陽性細(xì)胞比率為0.8％，CD71陽性細(xì)胞比率為96.2％。BMSCs的生

7、長曲線呈S形，S+G2+M期的細(xì)胞為17.1％，大部分細(xì)胞仍是處于靜止?fàn)顟B(tài)。BMSCs的超微結(jié)構(gòu)顯示BMSCs表面較多突起，孔隙較多，胞質(zhì)豐富，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)達(dá)，囊腔擴(kuò)張，可見大量蛋白分泌物，說明BMSCs具有較強(qiáng)的增殖能力。 結(jié)論： (1)應(yīng)用密度梯度離心法可得到純度較高的BMSCs。 (2)BMSCs表達(dá)基質(zhì)干細(xì)胞而非造血干細(xì)胞的表型特征。 (3)大部分細(xì)胞處于靜止?fàn)顟B(tài)，但BMSCs具有較強(qiáng)的增殖能力，

8、能夠在體外大量擴(kuò)增培養(yǎng)。 第三部分、表達(dá)Ad-mIL-18骨髓基質(zhì)干細(xì)胞對大鼠腦膠質(zhì)瘤的抑制作用 目的：觀察復(fù)制缺陷型腺病毒Ad-mIL-18感染BMSCs的效率、對BMSCs細(xì)胞生物學(xué)特性的影響和目的基因的表達(dá)，及研究腦內(nèi)移植對大鼠腦膠質(zhì)瘤的抑制作用，并對其作用機(jī)制做初步探討。 方法：以不同感染復(fù)數(shù)(multiplicityofinfection，MOI)空白對照(a)、50(b)、100(c)、200(d)、

9、的Ad-mIL-18感染BMSCs，熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率、MTT法檢測BMSCs增殖、β-巰基乙醇(β-mercaptoethanol，β-ME)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染Ad-mIL-18的BMSCs向神經(jīng)樣細(xì)胞分化、RT-PCR法及ELISA法分別檢測感染Ad-mIL-18的BMSCs3天后的mIL-18mRNA的表達(dá)和細(xì)胞因子的分泌。立體定向法建立9L/Fisher344大鼠腦膠質(zhì)瘤模型，3天后隨機(jī)將荷瘤大鼠分為：生理鹽水組(n=9)、BMSCs

10、移植組(n=10)、BMSCs-GFP移植組(n=10)和BMSCs-mIL-18移植組(n=10)，并進(jìn)行細(xì)胞移植；生理鹽水組:原位注射10μl生理鹽水、BMSCs移植組：1×106BMSCs(10μl)、BMSCs-GFP移植組：移植感染Ad-GFP的1×106BMSCs(10μl)、BMSCs-mIL-18移植組：移植感染Ad-mIL-18的1×106BMSCs(10μl)。觀察大鼠的神經(jīng)行為學(xué)變化、生存時間、MRI動態(tài)檢測腫瘤大

11、小、治療2周后分別采用RT-PCR法及ELISA法檢測腫瘤組織中mIL-18mRNA的表達(dá)和細(xì)胞因子的分泌、免疫組織化學(xué)法檢測大鼠大腦中CD4+、CD8+細(xì)胞表達(dá)。BMSCs-mIL-18移植組大鼠存活超過2月的再次原位接種同樣數(shù)量的9L細(xì)胞，觀察是否有免疫記憶效應(yīng)形成。 結(jié)果：Ad-mIL-18感染BMSCs后24h，即可見綠色熒光表達(dá)；一周時，不同感染復(fù)數(shù)(MOI)的感染率分別為：a(0)、b(55％)，c(85％)、d(8

12、8％)，但d組出現(xiàn)細(xì)胞病理現(xiàn)象；7d熒光表達(dá)最強(qiáng)；28d仍有表達(dá)。當(dāng)MOI達(dá)到200時，對細(xì)胞增殖產(chǎn)生抑制。經(jīng)β-ME誘導(dǎo)可以分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞。BMSCs感染Ad-mIL-18，3天后表達(dá)mIL-18mRNA，分泌mIL-18的量分別為：MOI=50(a)組：45.6±5.3(ng/106cells/72h)；MOI=100(b)組：89.2±4.9；(ng/106cells/72h)；MOI=200(C)組：90.8±4.1(ng/

13、106cells/72h)。統(tǒng)計學(xué)分析發(fā)現(xiàn)：a組與b、c組之間有顯著性差異(P<0.05)；而b、c組之間無顯著性差異(P=0.488)。2周時，各組大鼠腫瘤組織分泌mIL-18的量分別為：鹽水組1.6±0.3pg/mg；BMSCs移植組：1.8±0.1pg/mg；BMSCs-GFP組為1.8±0.1pg/mg：BMSCs-mIL-18移植治療組53.8±3.3pg/mg。BMSCs-mIL-18移植治療組與其余各組之間比較有顯著性差異

14、(P<0.01)生理鹽水組與BMSCs組(P=0.755)、BMSCs-GFP組(P=0.740)無顯著性差異。BMSCs-mIL-18移植組荷瘤大鼠的生存時間最長，40％大鼠存活時間超過60天，與其余各組比較有顯著性差異(P<0.01)；BMSCs及BMSCs-GFP移植組大鼠生存時間較生理鹽水組明顯延長(P<0.01)：BMSCs與BMSCs-GFP移植組之間無顯著性差異(P=0.919)。MRI檢測各組大鼠腫瘤大小發(fā)現(xiàn)：7天、14

15、天時BMSCs組、BMSCs-GFP組、BMSCs-mIL-18組與生理鹽水組比較有顯著性差異(P<0.01)，BMSCs-mIL-18組與BMSCs組、BMSCs-GFP組比較有顯著性差異(P<0.01)；而BMSCs組與BMSCs-GFP組之間無顯著性差異(7天時P=0.725；14天時P=0.620)；21天時生理鹽水組大鼠全部死亡，BMSCs-mIL-18組與BMSCs、BMSCs-GFP組比較均有顯著性差異(P<0.01)；而

16、BMSCs組與BMSCs-GFP組之間無顯著性差異(P=0.839)；28天時僅剩BMSCs-mIL-18組大鼠存活，28天、56天時它們的腫瘤體積仍相對較小，分別為51.30±2.56mm3和59.57±2.50mm3。免疫組化染色發(fā)現(xiàn)：BMSCs-mIL-18移植組大鼠腫瘤組織內(nèi)部及與正常腦組織邊界有大量CD4+、CD8+淋巴細(xì)胞浸潤，而BMSCs-GFP組未見CD4+、CD8+淋巴細(xì)胞浸潤。BMSCs-mIL-18組長期存活的再次

17、接種腫瘤細(xì)胞后存活時間超過90天。 結(jié)論： (1)復(fù)制缺陷型腺病毒pAd-mIL18可以有效感染Fisher344大鼠BMSCs，對BMSCs的細(xì)胞生物學(xué)特性無明顯影響。 (2)感染pAd-mIL18的BMSCs，不僅能夠在mRNA水平表達(dá)，而且能夠分泌一定量的細(xì)胞因子。 (3)立體定向技術(shù)建立9L/Fisher344腦膠質(zhì)瘤模型可靠、穩(wěn)定，適宜于進(jìn)行基因和免疫治療。 (4)BMSCs-mIL-1