胰高血糖素對新生大鼠心肌細(xì)胞生長及脂代謝的影響.pdf

1、目的：糖尿病心肌病是糖尿病的嚴(yán)重并發(fā)癥之一。它是以心肌肥大增生、心肌纖維化、心肌細(xì)胞凋亡、心肌細(xì)胞功能下降、細(xì)胞水平鈣轉(zhuǎn)運缺陷和脂肪酸代謝異常等為特征的心肌病變?？蓪?dǎo)致心力衰竭、心律失常、心絞痛、心源性休克和猝死。其發(fā)病機制還不清楚。胰高血糖素是胰島α細(xì)胞分泌的一種多肽激素，其主要生理作用是促進(jìn)糖原分解、抑制糖原合成和增強糖異生，使血糖升高。近年來對胰高血糖素也有了進(jìn)一步的認(rèn)識，強調(diào)了胰高血糖素在2型糖尿病發(fā)病機制中的地位。本研究擬證實

2、胰高血糖素對新生大鼠心肌細(xì)胞是否有非升糖促生長作用，是否可引起心肌脂代謝異常，并進(jìn)一步探討高胰高血糖素血癥在糖尿病及其心肌病變中的作用，為闡明糖尿病及其并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展的機制和研發(fā)新的治療策略尋找理論依據(jù)。
　　 方法：采用膠原酶消化法和差速貼壁法分離新生大鼠心肌細(xì)胞并做原代培養(yǎng)。常規(guī)培養(yǎng)心肌細(xì)胞72h后，更換為無血清的DMEM（Dulbecco modified Eagle medium）培養(yǎng)液。每5孔細(xì)胞為一組，共分7組，換培

3、養(yǎng)基的同時給藥：第一組為正常對照組，不給予藥物；第二組為給予濃度10-10mol/L胰高血糖素的高胰高血糖素組；第三組為給予25.5mmol/L葡萄糖的高糖組；第四組為給予10-7mol/L胰島素的高胰島素組；第五組為給予25.5mmol/L葡萄糖和10-10mol/L胰高血糖素的高糖高胰高血糖素組；第六組為給予25.5mmol/L葡萄糖和10-7mol/L胰島素的高糖高胰島素組；第七組在第六組基礎(chǔ)上加入10-10mol/L胰高血糖素的

4、高糖高胰島素高胰高血糖素組。給藥后每天在倒置相差顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)的觀察。給藥48 h后進(jìn)行各項指標(biāo)的測定。
　　 （1）倒置相差顯微鏡下觀察處理前后心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，臺盼藍(lán)染色法計數(shù)處理后各組細(xì)胞數(shù)目。（2）末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（terminal deoxynucleotidyl transferas，TdT）介導(dǎo)的生物素?；撗跄蛭羧姿幔╠eoxyuridine triphosphate，dUTP）生物素原位缺口末端

5、標(biāo)記法（TdT mediated dUTP nick end labeling，TUNEL）檢測心肌細(xì)胞凋亡情況，并計算心肌細(xì)胞凋亡率。（3）紫外分光光度法檢測細(xì)胞內(nèi)游離脂肪酸（free fatty acid，F(xiàn)FA）和脂蛋白脂酶（lipoprotein lipase，LPL）含量；生化法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液心肌酶[乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、肌酸激酶（creatine kinase，CK）和肌酸激酶

6、同工酶（MB isoenzyme of creatine kinase，CK-MB）]水平。
　　 結(jié)果：（1）新生大鼠心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)成功。
　　 （2）分組給藥后各實驗組心肌細(xì)胞數(shù)目均較對照組增多，細(xì)胞計數(shù)：正常對照組8.0×105/ml，高胰高血糖素組9.0×105/ml，高糖組9.1×105/ml，高胰島素組8.8×105/ml，高糖加高胰高血糖素組9.7×105/ml，高糖高胰島素組9.0×105/ml，高糖高

7、胰島素高胰高血糖素組10.0×105/ml。
　　 （3）分組給藥后檢測心肌細(xì)胞凋亡情況，鏡下各組均可見棕褐色核細(xì)胞，但多少不一，高糖組心肌細(xì)胞凋亡率32.80±2.64％，凋亡細(xì)胞較正常對照組明顯增多（t=20.941，P=0.000），差異有統(tǒng)計學(xué)意義；高胰高血糖素組與正常對照組比較（t=1.796，P=0.110），差異無統(tǒng)計學(xué)意義；高胰島素組與正常對照組比較（t=0.460，P=0.658），差異無統(tǒng)計學(xué)意義；3個混合組

8、與正常對照組比較，差異也無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。
　　 （4）高胰高血糖素組心肌細(xì)胞內(nèi)FFA（t=26.422，P=0.000）、LPL（t=6.295，P=0.002）均較正常對照組明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；高糖組FFA（t=39.269，P=0.000）、LPL（t=13.591，P=0.000）均較正常對照組明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；高胰島素組FFA（t=4.615，P=0.002）、LPL（t=4.913，P=

9、0.001）均較正常對照組明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；高糖高胰高血糖素組FFA（t=8.415，P=0.001）、LPL（t=14.052，P=0.000）均較正常對照組也明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；高糖高胰島素高胰高血糖素組LPL較正常對照組明顯升高（t=2.768，P=0.024），差異有統(tǒng)計學(xué)意義，兩組FFA比較（t=-1.948，P=0.087），差異無統(tǒng)計學(xué)意義；而高糖高胰島素組FFA（t=-0.146，P=0.887）、LP

10、L（t=0.948，P=0.371）與正常對照組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 （5）細(xì)胞培養(yǎng)液LDH水平高胰高血糖素組（t=5.090，P=0.001）、高糖組（t=2.601，P=0.032）及高糖高胰高血糖素組（t=3.228，P=0.012）與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義；其余各實驗組與對照組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 CK、CK-MB水平各實驗組與對照組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)論：