全肝缺血再灌注后心肌及線粒體損傷的機制及防護.pdf

1、背景與目的：肝臟移植術，肝臟大部切除術臨床上極為常見，手術技術相當成熟，但術中需要阻斷下腔靜脈，門靜脈及肝動脈的血流，手術過程復雜，造成全肝缺血再灌注損傷，不僅影響肝臟本身功能，對遠隔臟器-心臟也會造成損傷，全肝缺血再灌注引起心臟損傷的的病理生理機制，至今尚未完全闡明。
　　 本實驗用手術的方法建立大鼠的全肝缺血再灌注模型，動態(tài)檢測血漿H2S、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)、丙二醛(m

2、alondialdehyde，MDA)、血管緊張素II(angiotensin II，Ang II)、醛固酮(aldosterone，ALD)及血清心肌肌酸激酶同功酶(MB isoenzyme ofcreatine kinase，CK-MB)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)的變化，檢測心肌CSE活性及ALD、NF-kB含量，并用RT-PCR的方法檢測心肌CaNmRNA及ALDH2mRNA的表達，觀察心肌

3、組織CaN Aβ基因及ALDH2基因表達的變化，同時光鏡下觀察心肌的病理損傷，電鏡觀察心肌線粒體形態(tài)和結(jié)構的變化。并應用H2S供體NaHS、CaN抑制劑FK506、醛固酮拮抗劑螺內(nèi)酯及激素甲基強的松龍(methylprednisolone，MP)進行干預，觀察上述指標及線粒體琥珀酸脫氫酶(succinate dehydrogenase，SDH)活性、Ca2+-ATPase及Na+/K+-ATPase的活性變化，進一步研究H2S、CaN、

4、醛固酮及激素在全肝缺血再灌注心肌損傷中的信號傳導機制及各信號通路之間的相互作用，同時研究H2S、CaN抑制劑FK506、醛固酮受體拮抗劑螺內(nèi)酯及激素對心血管系統(tǒng)的保護作用。
　　 本研究分為三部分：
　　 一、全肝缺血再灌注心肌損傷的機理研究；
　　 二、全肝缺血再灌注后心肌損傷的保護及其保護機理研究；
　　 三、全肝缺血再灌注后心肌損傷的線粒體機制及其干預研究。
　　 方法：本實驗用手術的方法建

5、立大鼠的全肝缺血再灌注模型。
　　 第一部分:實驗分組：雄性Wistar大鼠88只，隨機分為11組，每組8只：正常對照組；缺血20min組；缺血40min組；缺血20min再灌注2h組；缺血20min再灌注6h組；缺血20min再灌注12h組；缺血20min再灌注24h組；缺血20min再灌注48h組；缺血20min再灌注72h組；缺血40min再灌注6h組；缺血40min再灌注72h組。
　　 第二部分:實驗分組：雄性

6、Wistar大鼠128只，隨機分為16組，每組8只：正常對照組；缺血20min再灌注6h組；缺血40min再灌注6h組；缺血40min再灌注72h組；缺血20minFK506組：再通后立即給予腹腔注射FK506(0.1mg/kg)；缺血20min NaHS組：再通后立即給予腹腔注射NaHS(28μmol/kg)；缺血20min MP組：再通后立即給予腹腔注射MP(30mg/kg)；缺血20min螺內(nèi)酯組：螺內(nèi)酯每天灌胃(20mg/kg)

7、，6天后手術：FK506組：假手術后給予腹腔注射FK506(0.1mg/kg)；NaHS組：假手術后立即給予腹腔注射NaHS(28μmol/kg)；MP組：假手術后立即給予腹腔注射MP(30mg/kg)；螺內(nèi)酯組：螺內(nèi)酯每天灌胃(20mg/kg)持續(xù)6天后假手術；缺血40 min再灌注6h MP組：再通后立即給予腹腔注射MP(30mg/kg)，再灌后6h處死：缺血40 min再灌注6h螺內(nèi)酯組：螺內(nèi)酯術前6天每天灌胃(20mg/kg)，

8、再灌注后6h處死；缺血40 min再灌注72h MP組：再通后立即給予腹腔注射MP(30mg/kg)，再灌后72h處死；缺血40 min再灌注72h螺內(nèi)酯組：螺內(nèi)酯術前6天每天灌胃(20mg/kg)，再灌后72h處死.再通后觀察各組大鼠心肌病理、血漿H2S、MDA、Ang II、ALD、TNF-α的變化，血清CK-MB、LDH的變化，同時檢測各組大鼠心肌CSE活性、ALD、NF-kB含量；并用RT-PCR的方法檢測心肌CaN mRNA、

9、ALDH2 mRNA的表達。
　　 第三部分:實驗動物為80只雄性Wistar大鼠，隨機分為10組，每組8只：正常對照組；缺血20min再灌注6h組；FK506組：假手術后給予腹腔注射FK506(0.1mg/kg)； NaHS組：假手術后立即給予腹腔注射NaHS(28μmol/kg)；MP組：假手術后立即給予腹腔注射MP(30mg/kg)；螺內(nèi)酯組：螺內(nèi)酯每天灌胃(20mg/kg)持續(xù)6天后假手術；FK506干預組：再通后立即給

10、予腹腔注射FK506(0.1mg/kg)：NaHS干預組：再通后立即給予腹腔注射NaHS(28μmol/kg)；缺血20min MP干預組：再通后立即給予腹腔注射MP(30mg/kg)；缺血20min螺內(nèi)酯干預組：螺內(nèi)酯每天灌胃(20mg/kg)，6天后手術。觀察心肌線粒體膜電位、呼吸功能、SDH活性、Ca2+-ATPase及Na+/K+-ATPase的活性變化。
　　 結(jié)果：
　　 第一部分結(jié)果：與正常對照組比較，血漿

11、MDA、血清TNF-α在缺血20min即有明顯升高，再灌注后6h達高峰，其后雖有所下降，但仍維持在較高水平.血漿H2S于缺血20min開始明顯下降，再灌注后2h開始升高，6h達最高峰，至再灌注后72h逐漸恢復。而心肌CSE酶活性的變化稍晚于血漿H2S，于創(chuàng)傷后12h最低，72h后才逐漸恢復，
　　 第二部分結(jié)果：與全肝缺血再灌注組比，四種干預藥物血MDA、TNF-α、心肌NF-kB、ICAM-1含量均降低，NaHS組血漿H2S含

12、量增加，余藥物干預組血漿H2S含量減低，螺內(nèi)酯組與FK506組心肌CSE酶變化不明顯，余藥物干預組下降.
　　 第三部分結(jié)果：與正常對照組比，缺血20min再灌注6h組線粒體呼吸功能下降，RCR及P/O明顯降低，Na+/K+ATP酶，SDH酶及膜電位下降，Ca2+-ATP酶含量升高，與缺血20min再灌注6h組比較，NaHS組、FK506組、MP組心肌線粒體呼吸功能明顯改善，RCR、P/O及Na+/K+ ATP酶，SDH酶含量增

13、加，Ca2+- ATP酶含量升高，膜電位升高。與缺血20min再灌注6h組組比，螺內(nèi)酯組線粒體RCR、Na+/K+-ATP酶、SDH酶及膜電位增加，Ca2+-ATP酶減少。
　　 結(jié)論：全肝缺血再灌注后可以造成遠隔的心臟及線粒體損傷，全肝缺血再灌注后2～6小時，心肌損傷最重。炎細胞及炎性細胞因子的活化、過度的氧化應激、CaN信號通路及內(nèi)源性血漿H2S/心肌CSE體系均參與了全肝缺血再灌注后心肌損傷。外源性H2S補充及CaN抑制劑