在轉(zhuǎn)基因鼠模型中驗證豬MyoG啟動子驅(qū)動豬PPARγ基因的上調(diào)表達(dá).pdf

1、在近幾十年豬育種中，國內(nèi)外的研究一直注重豬瘦肉率的提高而忽略肌肉品質(zhì)。肌肉品質(zhì)一般表現(xiàn)為肉質(zhì)的嫩度、多汁性和口味，肌內(nèi)脂肪的提高能夠使肌肉的嫩度、多汁性得到提高。本實(shí)驗室已經(jīng)構(gòu)建了調(diào)節(jié)肌內(nèi)脂肪含量的肌肉特異性表達(dá)載體pGL3-MyoG-PPARγ-Flag-poly(A) Signal，主要包括豬肌肉特異性表達(dá)基因肌細(xì)胞生成素（Myogenin，MyoG）的啟動子和脂肪相關(guān)基因過氧化物酶體增殖激活受體γ（Peroxisome Proli

2、ferator-Activated Receptorsγ，PPARγ），質(zhì)粒的活性在C2C12細(xì)胞中得到驗證后進(jìn)行線性化處理，利用原核顯微注射法成功制備MyoG-PPARγ轉(zhuǎn)基因鼠。本試驗以轉(zhuǎn)基因鼠為模型，從MyoG-PPARγ轉(zhuǎn)基因鼠的表型、DNA水平、mRNA水平、蛋白水平這幾個方面驗證組織特異性啟動子MyoG對MyoG-PPARγ轉(zhuǎn)基因小鼠的影響和MyoG啟動子的活性。最終證明肌肉特異性啟動子MyoG可以驅(qū)動外源PPARγ基因在活

3、體水平上調(diào)表達(dá)。
　　主要研究結(jié)果如下:
　　1、分別對4只首建鼠進(jìn)行繁殖、建系。首建♂1鼠得到了穩(wěn)定遺傳的后代，截止目前已傳至F5代。首建♂1轉(zhuǎn)基因小鼠陽性率已達(dá)到95％，達(dá)到建系的標(biāo)準(zhǔn)。
　　2、繪制小鼠1-12周齡的體重增長曲線，以及對3個階段（1月齡、2月齡、3月齡）MyoG-PPARγ轉(zhuǎn)基因鼠和FVB野生型鼠血清中與脂肪相關(guān)的部分指標(biāo)檢測，研究結(jié)果表明:每個時間段MyoG-PPARγ轉(zhuǎn)基因鼠和FVB野生型鼠在

4、體重增長方面沒有顯著性差異(p＞0.05);1月齡、2月齡MyoG-PPARγ轉(zhuǎn)基因鼠和FVB野生型鼠血清中的總膽固醇和甘油三酯均差異顯著(p＜0.05)。所檢測的每只鼠的指標(biāo)均在FVB型鼠正常范圍之內(nèi)。這兩項結(jié)果確定外源基因的插入并不影響轉(zhuǎn)基因鼠的健康。
　　3、采用絕對定量PCR的技術(shù)，分析MyoG-PPARγ轉(zhuǎn)基因鼠拷貝數(shù)，結(jié)果表明:首建♂1鼠的拷貝數(shù)是2.24，說明外源基因并不是單拷貝插入。通過對隨機(jī)選擇的F0-F5代轉(zhuǎn)基

5、因陽性鼠拷貝數(shù)的統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)隨著繁殖代數(shù)的增加，MyoG-PPARγ轉(zhuǎn)基因鼠后代外源基因拷貝數(shù)大多都增加，也有少部分降低。
　　4、采用qRT-PCR技術(shù)，測定1月齡、2月齡、3月齡MyoG-PPARγ轉(zhuǎn)基因鼠外源基因PPARγ以及其下游靶基因脂肪酸結(jié)合蛋白基因(Adipocyte Fatty AcidBinding Proteins，A-FABP）、脂蛋白脂肪酶基因（Lipoprotein Lipase，LPL）mRNA水平的表達(dá)

6、量，發(fā)現(xiàn)MyoG-PPARγ轉(zhuǎn)基因鼠相對于FVB野生型鼠均有顯著性升高(p＜0.05)?？v向比較1月齡、2月齡、3月齡MyoG-PPARγ轉(zhuǎn)基因鼠外源基因PPARγ的表達(dá)量，1月齡Myo G-PPARγ轉(zhuǎn)基因鼠相對于FVB野生型鼠外源基因PPARγ的表達(dá)量提升最多。
　　5、采用Western Blot、免疫組化技術(shù)檢測外源基因PPARγ蛋白水平的變化，結(jié)果顯示，MyoG-PPARγ轉(zhuǎn)基因鼠相對于FVB野生型鼠PPARγ蛋白表達(dá)量