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1、鴨乙型肝炎病毒(Duck hepatisis B virus,DHBV)的基因組長(zhǎng)約3kb,是由一條完整的負(fù)鏈和一條不完整的正鏈組成的不完全雙鏈環(huán)狀結(jié)構(gòu)的DNA病毒,并且其正鏈與負(fù)鏈通過(guò)一段互補(bǔ)的重復(fù)序列連接。本試驗(yàn)首先通過(guò)PCR擴(kuò)增和測(cè)序獲得DHBV全長(zhǎng)基因序列,然后使用真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1構(gòu)建DHBV preS/S-C融合基因DNA疫苗,并對(duì)其誘導(dǎo)鴨體液免疫效果進(jìn)行初步研究。
1.鴨乙型肝炎病毒的全基因克隆與序列分析
2、r> 本試驗(yàn)從四川省疑似感染DHBV的櫻桃谷鴨體內(nèi)分離到一株DHBV,命名為DHBV SCP01;然后通過(guò)PCR擴(kuò)增、T克隆(pGM-T)與測(cè)序獲得該病毒的全長(zhǎng)基因序列,提交至NCBI,登錄號(hào)為KM676220?;蚪Y(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn),DHBV SCP01分離株的全長(zhǎng)基因?yàn)?021 bp,包含3個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORF),即ORF-C、ORF-S與ORF-P,分別編碼病毒的核心蛋白、表面蛋白與聚合酶蛋白,且均位于負(fù)鏈上。序列相似性分析發(fā)現(xiàn),DH
3、BV SCP01分離株與其它13株DHBV分離株的相似性介于89.47%~99.64%之間。其中,DHBV SCP01分離株與M32991分離株的相似性最低,僅為89.47%;與HQ214130(DHBV-XY)河南分離株的相似性最高,為99.64%。遺傳進(jìn)化分析和P蛋白標(biāo)志氨基酸分析表明,DHBV SCP01分離株屬于西方基因型。
2.DHBV preS基因的原核表達(dá)及其多克隆抗體的制備
運(yùn)用生物信息學(xué)軟件和在線預(yù)
4、測(cè)工具對(duì)DHBVSCP01分離株的表面蛋白(preS/S蛋白)進(jìn)行分析。結(jié)果表明,preS/S蛋白由328個(gè)氨基酸組成,分子量約為36.23 kDa;該蛋白有2個(gè)跨膜區(qū),分別位于162-184 aa和235-257 aa,不存在信號(hào)肽序列;preS/S蛋白的抗原表位主要集中在前160個(gè)氨基酸區(qū)域。所以,本試驗(yàn)選擇preS基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增,構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒;然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入Rosetta表達(dá)菌株中進(jìn)行大量誘導(dǎo)表達(dá)與純化,SDS-PAG
5、E與Western blot分析;接著將重組preS蛋白免疫昆明雌鼠以制備多克隆抗體,間接ELISA檢測(cè)鼠抗高免血清的抗體效價(jià)。結(jié)果表明,preS基因長(zhǎng)度為483 bp,并成功構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a(+)-preS;在37C、0.6 mg/mL IPTG誘導(dǎo)4h時(shí),重組preS蛋白的表達(dá)量最大,且該蛋白大小與預(yù)期相符合(重組preS蛋白理論值為38.6 kDa),為可溶性蛋白;多克隆抗體的效價(jià)為1∶25600。
3.DH
6、BV preS/S-C融合基因DNA疫苗的構(gòu)建及其表達(dá)
采用PCR擴(kuò)增DHBV SCP01分離株的preS/S基因和C基因,融合PCR擴(kuò)增preS/S-C基因,T克隆(pGEM-T);然后以pVAX1為載體,分別進(jìn)行酶切連接,構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-preS/S、pVAX1-C和pVAX1-preS/S-C;接著轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞,48 h后收集細(xì)胞樣品。酶切鑒定以及測(cè)序分析表明,克隆的preS/S基因、C基因和preS/S
7、-C基因長(zhǎng)度分別為987 bp、789 bp和1818 bp,與NCBI上公布的DHBV SCP01分離株的preS/S基因和C基因序列相似性均為100%,表明成功構(gòu)建了以上三種真核表達(dá)質(zhì)粒。免疫印跡(Western blot)分析發(fā)現(xiàn),細(xì)胞樣品均在預(yù)期位置出現(xiàn)相應(yīng)大小的條帶(preS/S蛋白,36.2 kDa;C蛋白,30.3 kDa; preS/S-C蛋白,67.5 kDa)。
4.DHBV preS/S-C融合基因DNA
8、疫苗的免疫原性研究
將20只1日齡的櫻桃谷鴨隨機(jī)平均分為5組,以300μg/只的免疫劑量將制備的DNA疫苗pVAX1(A組)、pVAX1-C(B組)、pVAX1-preS/S(C組)、pVAX1-preS/S+ pVAX1-C(D組)和pVAX1-preS/S-C(E組)分別經(jīng)肌肉注射免疫4日齡雛鴨;在雛鴨14日齡時(shí)以300μg/只的免疫劑量對(duì)其進(jìn)行第二次肌肉注射免疫。然后在首次免疫后2d、4d、6d、8d、10d、12d、1
9、4d、21 d、28 d、35d、42 d、49 d、56 d分別對(duì)雛鴨進(jìn)行靜脈采血,間接ELISA檢測(cè)免疫鴨血清中抗-preS和抗-C的抗體水平。結(jié)果表明,在首次免疫接種后21d,B組(1.5395±0.0599)、C組(1.5096±0.0452)、D組(1.4784±0.0462,1.4788±0.0571)和E組(1.6394±0.0462,1.6555±0.0421)的抗體水平均達(dá)到最高,均極顯著(P<0.001)高于A組(0
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